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目的:女性乳腺癌是目前全球发病率最高的恶性肿瘤,乳腺恶性肿瘤在肿瘤内部及肿瘤间包含大量异质的遗传信息和表观遗传信息。乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells,BCSCs）这一微量细胞亚群是肿瘤发生、自我更新和异质性的驱动因素,是肿瘤耐药、放疗抵抗和复发转移的根源。将BCSCs作为靶点进行肿瘤治疗的模式具有较大的探索空间和临床价值。因此找到特异性的肿瘤干细胞指标及对其生物学特性和分子机制的研究具有现实意义。转录因子锌指E-盒结合同源异形盒1（zinc finger E-box binding homeobox 1,ZEB1）对于调控细胞分化和组织特异性方面具有重要作用,其是转录因子ZEB家族的重要成员。ZEB1可以通过调控恶性肿瘤的上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）促进肿瘤的恶性表型,在多种恶性肿瘤中呈现异常表达,其调控肿瘤细胞顺应性,在肿瘤发生发展的各个阶段起着关键作用。本研究望明确ZEB1在不同临床病理因素下的乳腺癌组织中的表达水平,并分析其表达与生存预后之间的关系,同时进一步阐明ZEB1在促进乳腺癌肿瘤干细胞特性的生物学特性及其独立于EMT的分子调控机制,有望发现BCSCs新的基因表达调控网络,为乳腺癌干细胞靶向治疗提供一全新的理论方向,同时为深入研究ZEB1在恶性肿瘤中非EMT依赖的调控机制补充证据。研究方法:1.诱导MCF-7 CSCs和T47D CSCs乳腺癌干细胞系并对其BCSCs样特性进行鉴定:使用无血清悬浮条件培养,将乳腺癌细胞MCF-7和T47D诱导成乳腺癌干细胞MCF-7 CSCs和T47D CSCs。进行形态学观察,同时通过q RT-PCR、Western blot检测相关干性指标表达的变化,通过流式细胞术、琼脂糖克隆形成实验、CCK-8实验和Transwell迁移等细胞实验鉴定MCF-7 CSCs和T47D CSCs的乳腺癌干细胞样特征。2.基于生物信息学的分析:提取TCGA中RNA-Seq数据,分析ZEB1在CD44+CD24-/low及非CD44+CD24-/low乳腺癌患者中表达的差异,同时分析干性通路相关指标在ZEB1高表达和低表达患者之间的差异。3.乳腺癌组织样本中ZEB1的表达及临床意义分析:在110例乳腺癌组织中检测ZEB1（免疫组化）和LUCAT1（免疫原位杂交）的表达,应用Pearson卡方检验和logistic回归分析ZEB1与临床病理因素及LUCAT1表达的相关性,通过Kaplan-Meier生存分析,统计ZEB1高表达与低表达乳腺癌患者的预后生存差异。4.细胞学实验:通过质粒转染构建ZEB1和LUCAT1过表达和沉默的细胞模型,通过转染mimic或inhibitor在细胞系中建立mi RNA的不同表达。利用q RT-PCR和Western blot检测乳腺癌干细胞相关标志物的表达水平;在相应细胞系中进行平板克隆实验和球囊形成实验,以检测细胞的增殖和自我更新能力;同时通过流式细胞术检测乳腺癌干细胞表面标志物CD44和CD24的表达,明确不同细胞系间CD44+CD24-/low细胞亚群的占比差异。5.相关靶基因的生物信息学预测及分子机制的研究:本研究利用了JASPAR、mi Randa及Target Scan等生物信息学数据库,对相关基因的潜在结合位点进行生信预测;ZEB1和LUCAT1启动子、mi R-5582-3p和ZEB1之间的特异性结合序列通过双荧光素酶报告基因实验进行验证;通过染色质免疫共沉淀验证ZEB1与LUCAT1启动子区的直接结合;RNA pull down实验验证mi R-5582-3p与ZEB1的特异性结合。结果:1.经过悬浮诱导培养后,MCF-7和T47D的细胞形态发生明显变化,呈球囊样生长;与亲本细胞相比,干细胞标记物OCT4、NANOG和SOX2的m RNA和蛋白水平表达提高（p<0.05）;MCF-7 CSCs和T47D CSCs中CD44+CD24-/low细胞群的比例提高（p<0.0001）;克隆形成能力显著增强（p<0.01）,MCF-7 CSCs和T47D CSCs具有更强的迁移能力（p<0.01）,对紫杉醇具有明显的药物抵抗。2.ZEB1在乳腺癌组织中的表达与淋巴结转移（p<0.001）,HER2阳性表达（p<0.001）,Ki-67状态（p=0.014）,组织学分级（p=0.042）和TNM分期（p<0.001）相关。ZEB1表达较高的患者的总生存（HR=2.37,p=0.002）和无病生存期（HR=1.910,p=0.038）较短。3.TCGA分析提示ZEB1在CD44+CD24-/low的乳腺癌患者中高表达（p<0.05）,且与Hedgehog干性通路相关指标的表达呈正相关（p<0.0001）。4.ZEB1促进乳腺癌干细胞样特性:在MCF-7和T47D中过表达ZEB1后,OCT4、NANOG和SOX2的m RNA和蛋白水平表达提高（p<0.01）,CD44+CD24-/low细胞亚群的比例提高（p<0.0001）,增殖及集落形成能力增强（p<0.05）;相反,在MCF-7 CSCs和T47D CSCs中沉默ZEB1后,BCSCs相关指标的m RNA和蛋白水平表达降低（p<0.01）,CD44+CD24-/low细胞亚群显著减少（p<0.0001）,细胞自我更新能力明显降低（p<0.01）。5.ZEB1与LUCAT1启动子区结合,调控LUCAT1转录介导乳腺癌干细胞生物学特性;LUCAT1被ZEB1转录激活竞争性结合mi R-5582-3p,释放ZEB1的转录活性,即ZEB1/LUCAT1/mi R-5582-3p环路介导BCSCs干细胞特性。结论:1.ZEB1具有调控乳腺癌干细胞特性的生物学功能,乳腺癌中ZEB1高表达提示预后不良。2.ZEB1通过调控长链非编码RNA LUCAT1的转录介导乳腺癌干细胞生物学特性,下游mi R-5582-3p在被LUCAT1竞争性结合后,ZEB1被释放激活,形成ZEB1/LUCAT1/mi R-5582-3p的调控环路。