随着世界人口的增多,牛奶作为首要的营养物质,需求量与日俱增。牛奶中80%-82%的乳蛋白为酪蛋白,酪蛋白含有人体必需的8种必需氨基酸,具有很高的营养价值。因此改善牛奶品质,提高乳蛋白的比例,是奶业生产面临的重要任务之一。乳蛋白只在泌乳期乳腺组织中表达,90%的乳蛋白是在乳腺上皮细胞中从头合成的。氨基酸是乳蛋白合成的原料。氨基酸被细胞摄取需要特异的氨基酸转运载体介导。因此,氨基酸转运载体的表达和活性可能会限制营养素供给,从而影响乳蛋白合成速率。L型氨基酸转运载体1(L-type amino acid transporter 1,LAT1)是一类对中性氨基酸起主要转运作用的氨基酸转运载体,被认为是奶牛乳腺中转运必需氨基酸的重要转运蛋白,它与4F2hc(4F2 heavy chain)结合成异二聚体发挥转运活性。甲硫氨酸是必需氨基酸的一种,许多研究表明,甲硫氨酸对乳蛋白的合成具有促进作用。然而在奶牛乳腺组织中,甲硫氨酸与LAT1表达之间的关系还不清楚,甲硫氨酸是否会调节LAT1表达,进而影响乳蛋白合成尚不明确。本研究以奶牛乳腺上皮细胞为实验模型,采用qRT-PCR和western blot方法检测了不同浓度甲硫氨酸对LAT1、4F2hc和β-酪蛋白表达的影响。结果显示随着甲硫氨酸浓度增加,奶牛乳腺上皮细胞中LAT1、4F2hc和β-酪蛋白表达增加。当甲硫氨酸浓度为0.6 mM时,LAT1、4F2hc和β-酪蛋白的表达最高。采用MTT方法检测甲硫氨酸对奶牛乳腺上皮细胞活力的影响,结果显示当甲硫氨酸浓度达到0.6 mM时,细胞活力最高。这些结果表明在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中,0.6 mM甲硫氨酸对LAT1、4F2hc以及β-酪蛋白的表达具有最佳的促进作用。氨基酸和激素能够引起细胞信号级联的介导和整合从而调控蛋白质合成速率。氨基酸对蛋白合成的调控多数是通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路介导的。mTOR是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,以两种复合物形式存在,分别是mTOR复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)和mTOR复合物2(mammalian target of rapamycin complex 2,mTORC2)。mTOR在mTORC1中与蛋白质Raptor结合,在mTORC2中与蛋白质Rictor结合。多种氨基酸可以激活mTOR信号途径调节蛋白合成以及机体的生长与代谢。为研究奶牛乳腺上皮细胞中甲硫氨酸是否可以通过调节mTOR信号通路,调节LAT1的表达,进而影响乳蛋白合成,本研究采用western blot方法研究了甲硫氨酸对mTOR信号通路分子及LAT1、4F2hc和β-酪蛋白表达的影响。通过雷帕霉素抑制剂以及RNA干扰方法抑制mTORC1信号通路,检测了mTORC1及其下游信号分子的磷酸化变化。结果显示甲硫氨酸可以激活mTOR及其下游分子p70核糖体蛋白S6激酶(p70 ribosomal protein S6 kinase,p70S6K)和真核生物起始翻译因子4E结合蛋白1(Eukaryotic Translation Initiation Factor 4EBinding Protein1,4E-BP1)。当mTORC1被抑制,其下游分子p70S6K、4E-BP1磷酸化水平降低,同时LAT1、4F2hc和β-酪蛋白表达也相应降低。表明甲硫氨酸可以通过mTORC1途径调节LAT1表达进而调节乳蛋白合成。但LAT1的表达并没有完全被抑制,说明有可能存在其他途径参与调节LAT1的表达。本研究通过RNA干扰方法抑制mTORC2信号通路,结果显示mTORC2下游信号分子AKT的磷酸化降低,同时LAT1、4F2hc和β-酪蛋白的表达量也明显降低。表明mTORC2也参与了甲硫氨酸对LAT1表达的调控,从而影响乳蛋白合成。该研究结果丰富了泌乳生物学的基础理论,可为通过膳食或其他途径调节奶牛摄取的营养组分,改善牛奶品质提供实验支持。