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1.研究背景及目的胰腺癌是恶性程度极高并且术后生存率极低的实体肿瘤,其发病隐匿的临床特点导致确诊时患者已多伴有远处转移并导致造成极差的预后,因此胰腺癌的早期诊断是目前研究的热点。近年来发现新发糖尿病是胰腺癌的病程发展中的早期并发症,在胰腺癌相关新发糖尿病模型中筛查出诊断相关的分子标记物,使其作为胰腺癌早期的特异的诊断依据有极强的可行性。本课题组前期研究发现,Vanin-1可作为胰腺癌相关新发糖尿病的一个有潜力分子标记物之一。Vanin-1,又称重组人血管非炎性因子,是近年来新发现的与炎症调控和氧化应激相关的基因。Vanin-1基因的下游产物cysteamine是调控胰岛细胞的活力及影响胰岛合成和释放胰岛素的功能的重要因子。目前研究表明:炎症因子和氧化应激的刺激会造成胰岛功能降低和胰岛B细胞的凋亡,在Ⅱ型糖尿病和胰腺癌相关糖尿病的发生发展中扮演了重要的角色。而Vanin-1在胰腺癌相关新发糖尿病的具体作用及机制还尚未清晰。在本实验中,我们通过一系列体外实验验证了Vanin-1的表达对胰岛活力、功能等的影响,并初步探讨了它在胰腺癌相关新发糖尿病中的具体作用和机制。实验目的:通过观察不同生物学行为的野生型与基因改造型的胰腺癌细胞系在、Vanin-1表达量差异的情况下与胰岛细胞共培养后对胰岛细胞活力和功能的影响,研究Vanin-1高表达与胰腺癌抑制胰岛功能是否存在正相关,并初步探讨其下游调控机制。2.实验方法:2.1挑选适宜进行Vanin-1基因过表达或沉默的胰腺癌细胞株,建立稳定转染的Vanin-1+的胰腺癌细胞系,并将野生型和转染空载体的胰腺癌细胞系作为对照组。将野生型胰腺癌细胞系(Bxpc-3, Mia Paca-2),稳定转染Vanin-1+统称(BV,MV)或空载体(以下统称BE,ME)的胰腺癌细胞系,分别与小鼠p细胞株(p-TC)进行共培养后,测定胞体内及培养液中的胰岛素含量,并进行胰岛素释放试验;同时将收集的胰腺癌细胞株(Bxpc-3, Mia Paca-2, BE,ME,BV,MV)的6天后的条件培养液,处理p细胞株(β-TC和INS-1)观察并利用MTT, WB,流式细胞仪检测胰岛细胞活力和凋亡蛋白的变化。2.2.研究Vanin-1/GSH、Vanin-1/cysteamine及Vanin-1/PPAR-Y通路的机制。对收集的胰腺癌细胞株(Bxpc-3, Mia Paca-2,BE,ME,BV,MV)的6天后的条件培养液,通过ELISA检测其中GSH的含量;通过ROS探针染色检测共培养后胰岛细胞的ROS的生成量。通过HPLC等技术研究Vanin-1的下游产物cysteamine的含量。通过ELISA检测条件培养液处理后胰岛细胞的PPAR-y活性的变化,通过WB检测PPAR-y蛋白的表达。2.3.将p细胞株在短期分时间点分别给于GSH或PPAR-y激动剂TZD干预(1mM及10mM),观察胰岛活力及功能的变化,然后用不同的条件培养液处理,同样用MTT, WB, ROS, ELISA等方法检验胰岛细胞的活力,功能,氧化应激和PPAR-y的活性是否改善。3实验结果:3.1.胰腺癌细胞系(Bxpc-3, Mia Paca-2, BE,ME,BV,MV)与p细胞株(β-TC)进行共培养后,BV,MV组细胞内和培养液中的胰岛素含量较对照组(M.B)和(ME,BE)显著降低,并且明显抑制了各时间段的胰岛素释放。收集胰腺癌细胞株(Bxpc-3, Mia Paca-2, BE,ME,B V,MV)的6天后的条件培养液,处理p细胞株(p-TC和INS-1)后,结果MTT检验出不同时间点(12h,24h,48h)的胰岛细胞活力较对照组明显降低,WB检测出(BV,MV)组胰岛凋亡蛋白PARP-1较对照组表达上调,Casepase-3的前体表达下降,凋亡抑制蛋白BCL-2较对照组表达下调;观察ROS探针染色得出检测用(BV,MV)组的处理的胰岛细胞内ROS的生成较对照组明显。3.2胰腺癌细胞系(BV,MV)6天后的条件培养液中GSH的含量较对照组(同上)明显降低;观察ROS探针染色发现BV,MV组处理后的胰岛细胞内ROS的生成较对照组明显;通过HPLC等技术检测出条件培养液中cysteamine的含量较对照组明显升高;ELISA证实条件培养液处理的胰岛细胞的裂解液中PPAR-y活性较对照组明显下调。3.3.用胰腺癌细胞系的条件培养液处理或者与(B,M,BE.ME,BV,MV)共培养后的p细胞株分时间点给于GSH或PPAR-y激动剂TZD干预后,胰岛活力及功能得到改善,细胞内ROS含量降低,PPAR-y的活性升高。4.结论:4.1胰腺癌细胞系Vanin-1的表达量与胰岛功能抑制间存在正相关。4.2胰腺癌细胞Vanin-1表达量的增加可抑制PPAR-y的活性,增加cysteamine的释放及氧化应激反应,从而抑制胰岛细胞的胰岛素合成/释放功能,并促进胰岛细胞的凋亡。