研究背景乳腺癌在女性恶性肿瘤中的发病率位居第一位。2015年全中国范围内预计大约有281.4万人死于癌症,其中死于乳腺癌的患者大约有7.07万人,是45岁以下女性最常见的癌症死因。近些年,随着我国经济飞速发展及人口老龄化进程的加快,乳腺癌的发病率也在逐年攀升。尽管新世纪以来乳腺癌的诊疗发生了日新月异的变革,我国乳腺癌患者的术后5年生存率由以往的50%左右提高至80%,欧美国家的术后5年生存率亦出现了上升的趋势,但由于发病率逐年上升,仍然严重威胁着女性的健康。因此,早期诊断对于乳腺癌患者的预后至关重要。虽然近些年来,许多临床医生开展了大量的工作来筛选与乳腺癌的发生、转移预后相关的标志物,并取得了一定成果,但仍未筛选出真正敏感特异的与乳腺癌癌变相关的基因。人宫颈癌基因(Human cervical cancer oncogenes, HCCRs)是从宫颈癌组织及细胞系中筛选得到的,并且发现其在宫颈癌及宫颈癌细胞系中高表达。HCCRs定位于人染色体的12q,编码两种蛋白HCCR-1和HCCR-2。目前的多项科研成果显示HCCR-1与多种恶性肿瘤相关,它除了在宫颈癌中高表达外,在其它肿瘤如肝癌、卵巢癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌及白血病中亦高度表达,甚至有研究表明HCCR-1可以作为肝癌及乳腺癌诊断的标志物。在前期的研究中我们也已经证实HCCR-1在结肠癌中高表达,并且与结肠癌的生物学进程相关。Bax (Bcl-2 associated X protein)是Oltvai等于1993年发现的一种与Bcl-2共沉淀的蛋白质,它与Bcl-2蛋白具有部分同源性,隶属于Bcl-2家族,是一种重要的细胞凋亡促进基因。它的表达产物与Bcl-2蛋白结合为异源二聚体,调控Bcl-2的活性,抑制了Bcl-2的抗凋亡作用,是Bcl-2家族调节细胞凋亡的关键点。研究表明Bax蛋白往往在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌等肿瘤组织中低表达。新近的报道提出,HCCR-2通过多种渠道使P53基因的活性丧失,抑制其下游基因Bax的表达,并在恶性肿瘤的生物学进程中发挥了重要的作用,但关于HCC R-1在乳腺癌组织中的表达与细胞凋亡促进基因Bax之间的关系目前尚无文献报道。本研究旨在通过检测HCCR-1及Bax在人乳腺癌组织、癌旁正常组织及乳腺腺病组织中的表达差异,检测下调HCCR-1表达对乳腺癌MCF-7细胞中Bax表达变化及对MCF-7细胞增殖、凋亡的影响,分析HCC R-1及Bax的表达与人乳腺癌临床病理学因素间的相关性,对HCCR-1及Bax表达与乳腺癌发展、侵袭以及转移的联系以及潜在的分子生物学机制进行初步研究。第一部分人乳腺癌组织中HCCR-1、Bax基因的表达目的：探讨HCCR-1及Bax基因在乳腺癌组织、癌旁正常组织及乳腺腺病组织中的表达差异。方法：1.选取30例2014.11-2015.04在山东大学齐鲁医院手术的乳腺癌患者的组织标本制作成30对乳腺癌及癌旁正常组织的配对组织蜡块,选取同一时期手术的30例乳腺腺病作为良性病变进行研究；2.分别采用实时荧光定量PCR及免疫组化技术分析HCCR-1、Bax基因在30对乳腺癌、癌旁正常组织及30例乳腺腺病中的表达水平。结果：1.30对乳腺癌、癌旁正常组织及30例乳腺腺病组织中HCCR-1、Bax实时荧光定量PCR检测结果：HCCR-1的mRNA的相对表达强度在乳腺癌腺组织中为1.76士0.10,高于乳腺腺病的相对表达强度1.092+0.201及癌旁正常组织中的相对表达强度1.00(P<0.05);而Bax的mRNA的相对表达强度在乳腺癌组织中为0.57±0.08,低于乳腺腺病的相对表达强度1.103+0.046及癌旁正常组织中的相对表达强度1.00(P<0.05)。2.30对乳腺癌、癌旁正常组织及30例乳腺腺病中HCCR-1、Bax免疫组织化学结果显示：HCCR-1及Bax蛋白免疫组化阳性表达主要定位于细胞胞浆。HCCR-1在30例乳腺癌中阳性表达21例,阳性率为70.0%；在30例癌旁正常组织标本中的阳性表达13例,阳性率为43.3%;两者有统计学差异(χ2=4.34,P<0.05)。在30例乳腺腺病中,HCCR-1蛋白的阳性表达率为40.0%(12/30),低于乳腺癌组织的阳性表达率(χ2=5.45,P<0.05),而与癌旁组织无统计学差异(χ2=0.07,P>0.05)。Bax在30例乳腺癌中阳性表达14例,阳性率为46.7%；在30例癌旁正常组织标本中的阳性表达23例,阳性率为76.7%；两者有统计学差异(χ2=7.11,P<0.01)。在30例乳腺腺病中,Bax蛋白的阳性表达率为83.3%(25/30),高于乳腺癌组织的阳性表达率(χ2=8.86,P<0.05),而与癌旁组织无统计学差异(χ2=0.42,P>0.05)。第二部分下调HCCR-1表达对乳腺癌细胞增殖、凋亡及Bax表达的影响目的：探讨siRNA下调HCCR-1表达对乳腺癌细胞MCF-7增殖、凋亡及Bax表达的影响。方法：1.将FuGENE6/HCCR-1 siRNA转染复合物转染至乳腺癌细胞株MCF-7中。2.使用实时免疫荧光定量PCR及Western Blot技术检测不同分组MCF-7细胞中HCCR-1及Bax表达情况变化。3.利用流式细胞仪及MTT法检测不同分组MCF-7细胞的凋亡及增殖变化情况。结果：1.不同分组间HCCR-1 mRNA变化情况：与空白组(1.00)及对照组(1.01±0.11)相比,实验组的HCCR-1 mRNA表达(0.464±0.03)显著下调,且差异具有统计学意义(χ2<0.05);而对照组HCCR-1 mRNA表达与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。2.不同分组间HCCR-1蛋白变化情况：与空白组(0.944±0.17)及对照组(0.89±0.09)相比,实验组的HCCR-1蛋白表达(0.62±0.07)显著下调,且差异具有统计学意义(P<0.05)；而对照组HCCR-1蛋白表达与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。3.不同分组间Bax mRNA变化情况：与空白组(1.00)及对照组(1.03±0.10)相比,实验组的Bax mRNA表达(4.40±0.99)显著上升,且差异具有统计学意义(P<0.05);而对照组Bax mRNA表达与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。4.不同分组间Bax蛋白变化情况：与空白组(0.69±0.11)及对照组(0.67±0.19)相比,实验组的Bax蛋白表达(0.95±0.22)显著上升,且差异具有统计学意义(P<0.05);而对照组Bax蛋白表达与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。5.不同分组间细胞增殖变化情况：与空白组(24h：1.244±0.05；48h：1.54±0.04;72h：1.84±0.04)及对照组(24h：1.18+0.05；48h:1.48+0.02；72h:1.81±0.02)相比,实验组的细胞增殖在转染后24h(0.78+0.06)、48h(1.09±0.05)、72h(1.29±0.01)均受到显著抑制,且差异具有统计学意义(P<0.05),而空白组与对照组之间无统计学差异(P>0.05)。6.不同分组间细胞凋亡变化情况：实验组凋亡率为(32.57+2.35)%,对照组凋亡率为(3.53±0.60)%,空白组凋亡率为(3.15+0.46)%,实验组与对照组比较具有统计学差异(P<0.05),而对照组与空白组比较则无差异(P>0.05)。第三部分HCCR-1及Bax的表达与乳腺癌临床病理因素的相关性分析目的：为减少统计误差,检测HCCR-1、Bax在大样本乳腺癌中的表达情况,并结合相关临床病理资料进行分析。方法：1.收集2012.03-2015.06期间于山东大学齐鲁医院手术且资料相对完整的120例乳腺癌蜡块,每例选取2处典型部位构建组织芯片。2.采用免疫组化技术分析HCCR-1、Bax基因在组织芯片中的表达情况。3.结合相关临床病理资料进行统计分析。结果：1.组织芯片制作结果：共制作组织芯片蜡块6块,共计252点位,其中每个蜡块包含空白点位2个。每个蜡块匀质,内无气泡开裂等现象,微阵列排列均匀整齐、间距适中。经免疫组化染色后的组织芯片随机由2位病理学主治医师判读,存在部分位点脱片、移位、无效组织等现象。最终实际有效病例为106例。2.第一部分中30例乳腺癌病例加上组织芯片中的实际有效病例106例,共136例乳腺癌。免疫组织化学结果显示：在总共136例乳腺癌组织中,Bax阳性表达61例,阳性率为44.9%,HCCR-1阳性表达89例,阳性率为65.4%。两者的阳性率相比具有统计学意义(χ2=5.83,P<0.05)。HCCR-1阳性表达的89例中Bax阳性表达的有25例；Bax阳性表达的61例中HCCR-1阴性表达的有36例,二者阳性表达间呈负相关性(P<0.01,相关性系数γ=-0.464)。3.HCCR-1及Bax表达与乳腺癌临床病理特征的关系：乳腺癌pTNM临床病理分期Ⅲ-Ⅳ期中HCCR-1表达阳性率[87.5%(21/24)]高于Ⅰ-Ⅱ期中阳性率[60.7%(68/112)],呈正相关趋势(χ2=6.27,P<0.05)；随着组织学分级的递增HCCR-1阳性率亦逐渐升高呈正相关趋势(χ2=6.35,P<0.05)；HCCR-1在有淋巴结转移的乳腺癌组织中的阳性率[75.7%(53/70)]要高于无淋巴结转移乳腺癌组织[54.5%(36/66)],呈正相关趋势(χ2=6.73,P<0.05);HCCR-1在雌激素受体阳性的乳腺癌组织中的阳性率[71.4%(70/98)]要高于雌激素受体阴性的乳腺癌组织[39.1%(9/23)],HCCR-1的过量表达与雌激素表达情况正相关(χ2=8.57,P<0.05)；但HCCR-1表达与患者的年龄、肿瘤大小及孕激素表达情况无关。Bax的阳性率随着乳腺癌肿块大小的递增而逐渐下降呈负相关趋势(χ2=6.53,P<0.05)；Bax在有淋巴结转移的乳腺癌组织中的阳性率[34.3%(24/70)]要低于无淋巴结转移乳腺癌组织[56.1%(37/66)],呈负相关趋势(χ2=6.51,P<0.05)；但Bax表达与患者的年龄、雌孕激素表达情况、病理学pTNM分级及组织学分级无关。结论：HCCR-1在乳腺癌组织中表达高于癌旁正常组织及乳腺腺病组织,而Bax在乳腺癌组织中表达低于癌旁正常组织及乳腺腺病组织；抑制HCCR-1基因的表达对乳腺癌MCF-7细胞株的凋亡有促进作用,而对其增殖有抑制作用,并且与Bax基因在MCF-7细胞株中的表达负相关；HCCR-1的过量表达与乳腺癌淋巴转移、ER表达、组织学分级及pTNM临床病理分级相关,而与患者性年龄、PR表达及肿瘤大小无关；Bax的过量表达与乳腺癌淋巴转移、肿瘤大小相关,而与患者性年龄、ER表达、PR表达、组织学分级及pTNM临床病理分级无关。