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目的皮肤老化的机制不明,且临床实际中缺乏皮肤老化判断的客观指标。本课题以青年、中年、老年人曝光部位及非曝光部位的皮肤为研究对象,探寻其中差异表达的蛋白或特异表达的蛋白有可能成为皮肤老化的标志性蛋白,探讨角质形成细胞在皮肤老化过程中的作用及分子机制。为后续研究全面解释皮肤老化的机制,揭示衰老的本质奠定基础。方法借助蛋白质组学研究技术平台,采用Dispase Ⅱ分离出表皮,优化改进样本处理方法,使用加入了cocktail,RNase和DNase的裂解液提取表皮组织总蛋白,经等电聚焦和垂直电泳,银染后获得了表皮组织中角质形成细胞2-DE图像,建立和优化了适合于表皮组织研究的双向凝胶电泳方法。染色后的凝胶用GS800密度扫描仪扫描,并用PDQuest7.4图像分析软件进行图像分析,强度校正、背景消减、点检测、匹配、ID校正,确定差异蛋白点。挑选其中的蛋白点进一步行MALDI-TOF质谱分析及数据库查询,最后鉴定差异候选蛋白。结果获得的双向凝胶电泳图谱较为清晰,蛋白质点分离完全,各组重复3次后得到的图谱非常相似,进行3块胶间的蛋白质点的匹配,测量胶间蛋白质点在第一向IEF方向的偏差为(1.798±1.232)mm,在第二向SDS-PAGE方向上的偏差为(1.063±1.031)mm,获得了重复性较好匹配率高的表皮组织双向凝胶电泳图谱,由此成功建立了适合人表皮组织比较蛋白质组研究的双向凝胶电泳方法。角质形成细胞蛋白在pH3-10的范围均有分布,但主要集中分布在pH 5-8范围内,相对分子质量主要集中在19-110k0之间。在pH 5-8范围内蛋白点的检测、量化和点的匹配结果显示：青年组曝光部位角质形成细胞的平均蛋白点数为387±21,3块胶间蛋白质点的匹配率达81.6%。中年组曝光部位角质形成细胞平均蛋白点数为380±31,3块胶间蛋白质点的匹配率达83.7%。分析比较两组2-DE图谱共确定43个差异蛋白点,其中12个蛋白点在青年组曝光部位2-DE图谱中高表达,17个蛋白点在中年组曝光部位2-DE图谱中高表达,14个蛋白点在两者间有2倍以上显著性量变。中年组曝光部位角质形成细胞的平均蛋白点数为380±31,3块胶间蛋白质点的匹配率达83.7%。老年组曝光部位角质形成细胞平均蛋白点数为365±17,3块胶间蛋白质点的匹配率达84.5%。分析比较两组2-DE图谱共确定38个差异蛋白点,其中13个蛋白点在中年组曝光部位2-DE图谱中高表达,5个蛋白点在老年组曝光部位2-DE图谱中高表达,20个蛋白点在两者间有2倍以上显著性量变。青年组非曝光部位角质形成细胞的平均蛋白点数为372±18,3块胶间蛋白质点的匹配率达82.2%。中年组非曝光部位角质形成细胞平均蛋白点数为363±19,3块胶间蛋白质点的匹配率达85.8%。分析比较两组2-DE图谱共确定47个差异蛋白点,其中16个蛋白点在青年组非曝光部位2-DE图谱中高表达,9个蛋白点在中年组非曝光部位2-DE图谱中高表达,22个蛋白点在两者间有2倍以上显著性量变。中年组非曝光部位角质形成细胞平均蛋白点数为363±19,3块胶间蛋白质点的匹配率达85.8%。老年组非曝光部位角质形成细胞的平均蛋白点数为359±15,3块胶间蛋白质点的匹配率达83.4%。分析比较两组2-DE图谱共确定40个差异蛋白点,其中11个蛋白点在中年组非曝光部位2-DE图谱中高表达,8个蛋白点在老年组非曝光部位2-DE图谱中高表达,21个蛋白点在两者间有2倍以上显著性量变。青年组曝光部位角质形成细胞的平均蛋白点数为387±21,3块胶间蛋白质点的匹配率达81.6%。青年组非曝光部位角质形成细胞平均蛋白点数为372±18,3块胶间蛋白质点的匹配率达82.2%。分析比较两组2-DE图谱共确定48个差异蛋白点,其中17个蛋白点在青年组曝光部位2-DE图谱中高表达,11个蛋白点在青年组非曝光部位2-DE图谱中高表达,20个蛋白点在两者间有2倍以上显著性量变。中年组曝光部位角质形成细胞的平均蛋白点数为380±31,3块胶间蛋白质点的匹配率达83.7%。中年组非曝光部位角质形成细胞平均蛋白点数为363±19,3块胶间蛋白质点的匹配率达85.8%。分析比较两组2-DE图谱共确定43个差异蛋白点,其中12个蛋白点在中年组曝光部位2-DE图谱中高表达,13个蛋白点在中年组非曝光部位2-DE图谱中高表达,18个蛋白点在两者间有2倍以上显著性量变。老年组曝光部位角质形成细胞的平均蛋白点数为365±17,3块胶间蛋白质点的匹配率达84.5%。老年组非曝光部位角质形成细胞平均蛋白点数为359±15,3块胶间蛋白质点的匹配率达83.4%。分析比较两组2-DE图谱共确定37个差异蛋白点,其中9个蛋白点在老年组曝光部位2-DE图谱中高表达,14个蛋白点在老年组非曝光部位2-DE图谱中高表达,14个蛋白点在两者间有2倍以上显著性量变。选取其中的35个差异蛋白进行MALDI-TOF质谱分析及数据库查询,成功鉴定了21个与皮肤老化相关的候选蛋白。我们的实验获得了一些有价值的发现：在不同的年龄组、不同的部位检测到了相同的蛋白,3次检测到膜联蛋白A2 (annexin A2)、2次检测到角蛋白K2C80、2次检测到热休克蛋白、2次检测到谷胱甘肽s-转移酶(GSTs)、2次检测到白蛋白(albumin),提示这几种蛋白可能为皮肤老化中的重要蛋白质；通过组间的比较分析,在青年组和中年组曝光部位HSP高表达,在青年组和老年组曝光部位K2C80高表达,提示HSP和K2C80可能是光老化的特异蛋白；在青年组和中年组的非暴光部位都有膜联蛋白A2 (annexin A2)及谷胱甘肽s-转移酶(GSTs)的表达,在中年组和老年组的非暴光部位都有白蛋白(albumin)的表达,可能与自然老化密切相关；而P21可能与自然老化直接相关,HSP70与紫外线导致的皮肤光老化关系密切。结论利用蛋白质组的技术平台,建立了适合皮肤老化研究的比较蛋白质组的方法。通过比较不同部位、不同年龄人群中皮肤角质形成细胞在自然、连续、动态的成长过程中存在差异表达蛋白。鉴定的21个候选蛋白功能各异,它们通过参与细胞的基础能量代谢；影响蛋白质的合成、折叠、降解过程；调控细胞的生长、增殖、分化；参与细胞骨架蛋白的构建；参与细胞的凋亡、免疫调控。使细胞增殖能力降低,加速细胞的凋亡；损伤细胞之间的连接,分泌各种细胞因子,通过各种通路,加速胶原的降解,导致氧化和抗氧化的失衡,形成了错综复杂的网络体系,在自然老化和(或)光老化的过程发挥一定作用。我们探寻到其中差异表达的蛋白或特异表达的蛋白有可能成为皮肤老化的标志性蛋白,初步探讨了角质形成细胞在皮肤老化过程中的作用及分子机制,为揭示衰老的本质奠定了基础。但要确定某种蛋白是皮肤老化的标志性蛋白,尚需进一步验证。