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研究目的构建肺炎链球菌常见致病血清型19F、14、6A、23F及6B菌株以及北京标准株31108的LytA基因的原核重组质粒,运用生物信息学方法对其核苷酸及推测的氨基酸序列进行分析,了解不同血清型LytA基因核苷酸及氨基酸序列间的异同及遗传关系.进行原核重组表达,利用Western Blot分析对其抗原性进行初步研究,为开发肺炎链球菌疫苗及新药奠定基础.研究方法(1)药物敏感性实验:运用纸片法和青霉素E-test检测所收集的19F、14、6A、23F和6B血清型肺炎链球菌以及肺炎链球菌北京标准株31108的耐药情况.(2)LytA基因的克隆:分别提取以上6株不同血清型肺炎链球菌的基因组DNA.根据已知肺炎链球菌野生R6株LytA基因序列设计引物,进行PCR扩增,将获得的目的基因片段克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1.双酶切和测序对重组质粒进行鉴定.(3)不同血清型LytA基因的序列分析:利用生物信息学工具进行LytA基因的DNA及推测蛋白质序列的分析、比对.并对推测的蛋白分子的高级结构及可能的功能位点进行预测.(4)LytA基因的重组表达及纯化:诱导表达重组质粒pGEX-4T-1-LytA,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析.利用GSTrap.FF亲合层析柱和Thrombin,获得纯化重组LytA蛋白.(5)重组LytA的质谱分析:利用基体辅助激光解析飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)对所获得纯化蛋白产物进行进一步的鉴定.(6)重组蛋白的免疫学研究:分别用肺炎链球菌血清型19F的LytA融合蛋白凝胶-PBS悬液和菌液免疫大鼠,获得血清,双向免疫扩散试验和直接凝集反应(试管法)实验进行验证.Western Blot分析重组LytA蛋白分子的抗原性;交叉Western Blot分析不同血清型间重组LytA蛋白抗原性的异同.小结药物敏感性实验证明我们所研究的5株国内常见致病血清型的肺炎链球菌菌株均为多重耐药株及青霉素低度耐药株.从不同血清型肺炎链球菌基因组DNA中均扩增出了LytA基因序列,成功构建了6个重组质粒pGEX-4T-1-LytA;经IPTG诱导,6个重组质粒在大肠埃希菌BL21中高效表达.序列分析发现不同血清型菌株的LytA基因序列及氨基酸序列间存在差异,但在可能的功能位点处序列保守,无差异.重组表达产物纯化后,经质谱鉴定为肺炎链球菌的LytA蛋白.免疫学鉴定表明重组LytA具有抗原性及不同血清型间的交叉抗原性.