胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)是肠道L型细胞分泌的一种肠促胰岛素,主要的生理学作用包括进食后呈葡萄糖依赖性刺激胰岛素的分泌和释放,促进胰腺β细胞的增殖并抑制其凋亡,抑制胰高血糖素分泌,抑制胃排空,促进饱食感产生等。但GLP-1在体内容易被二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)降解,稳定性差,无法应用于临床,因此科研人员研发了多种GLP-1类似物。利拉鲁肽与人GLP-1有97%同源,半衰期约12~14小时;Exendin-4与哺乳动物GLP-1的氨基酸序列53%同源,为含有39个氨基酸的多肽,注射后2小时就可到达血药浓度峰值。由于利拉鲁肽和Exendin-4都不会被体内的DPP-Ⅳ降解,因此两者既克服了天然GLP-1易被降解的缺点,又保留了GLP-1的各种生理作用和治疗优势。利拉鲁肽和Exendin-4是目前临床上常用的降糖药,不仅可以控制血糖,还可通过多种途径影响骨代谢。Zhan等研究发现,GLP-1可以抑制Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor2,Runx2)的产生进而抑制小鼠血管平滑肌细胞的成骨分化。然而,多数体外研究证实,GLP-1可以促进成骨分化的发生。因此,GLP-1及其类似物到底是抑制还是促进成骨分化尚未定论。Smads是转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的信号转导和调节分子。已证实Wnt/β-catenin和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)信号通路均可调节Smad2和Smad3的活性和核转移,并参与成骨分化过程。此外,Hedgehog也是影响细胞分化的重要信号通路,Hedgehog信号可使骨髓间充质干细胞选择性向成骨细胞分化。为阐述胰高血糖素样肽-1类似物促进前成骨细胞的成骨分化及其机制,本研究分四部分:第一部分利拉鲁肽促进前成骨细胞向成骨分化;第二部分利拉鲁肽对前成骨细胞向成骨分化影响的信号通路研究;第三部分Exendin-4促进前成骨细胞向成骨分化;第四部分Exendin-4对前成骨细胞向成骨分化影响的信号通路研究。第一部分利拉鲁肽促进前成骨细胞向成骨分化目的:明确不同浓度利拉鲁肽对小鼠成样骨细胞mc3t3-e1增殖和分化的影响。方法:1将体外培养的小鼠成样骨细胞mc3t3-e1分为对照组和干预组(10-9mol/l利拉鲁肽,10-8mol/l利拉鲁肽,10-7mol/l利拉鲁肽),接种细胞后第24、48和72h对细胞进行ckk-8检测并利用流式细胞术进行细胞周期检测。2将普通培养液中培养的mc3t3-e1细胞设置为空白对照组,成骨培养液中培养的mc3t3-e1细胞设置为成骨对照组,成骨干预组中利拉鲁肽浓度分别设为10-9mol/l、10-8mol/l和10-7mol/l。不同浓度利拉鲁肽干预细胞48h后进行免疫荧光染色定位细胞glp-1受体(glucagon-likepeptide1receptor,glp-1r)的表达部位;分别取第3、7、14和21天的细胞进行碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,alp)活性测定和茜素红染色半定量测定;利用westernblot分析和real-timert-pcr检测检测细胞glp-1r、runx2和骨钙素(osteocalcin,ocn)的mrna水平和蛋白表达。结果:1利拉鲁肽对mc3t3-e1细胞的细胞活力和细胞周期均无显著影响。2mc3t3-e1细胞的细胞质与细胞核中均存在glp-1r,利拉鲁肽可以增加成骨培养基中mc3t3-e1细胞glp-1r的表达,并具有剂量依赖性;在成骨培养基中加入10-7mol/l利拉鲁肽后,14天时glp-1r表达增加最明显。3利拉鲁肽可剂量依赖性促进mc3t3-e1细胞向成骨细胞分化时的alp活性和钙沉积量。4利拉鲁肽上调runx2和ocn的mrna水平和蛋白表达,并具有剂量依赖性;runx2的mrna水平和蛋白表达在7天达到峰值,ocn的mrna水平和蛋白表达在21天达到峰值。第二部分利拉鲁肽对前成骨细胞向成骨分化影响的信号通路研究目的:探索smad2和smad3是否参与了利拉鲁肽促进小鼠成样骨细胞mc3t3-e1向成骨分化的过程,并进一步明确利拉鲁肽是否通过wnt/β-catenin信号通路和pi3k-akt信号通路调节smad2和smad3的转录和蛋白表达。方法:1将普通培养液中培养的mc3t3-e1细胞设置为空白对照组,成骨培养液中培养的mc3t3-e1细胞设置为成骨对照组,成骨干预组中利拉鲁肽浓度分别设为10-9mol/l、10-8mol/l和10-7mol/l。利用real-timert-pcr检测细胞smad2和smad3的基因表达水平,用westernblot分析技术检测p-smad2、smad2、p-smad3和smad3蛋白表达水平。2体外培养小鼠前成样骨细胞mc3t3-e1,经小干扰rna(smallinterferingrna,sirna)转染以沉默smad2和smad3基因表达。取成骨诱导培养条件下的mc3t3-e1细胞随机分为8组,分别为空白对照组、空载体组、空载体+利拉鲁肽组、smad2-sirna组、sismad2+利拉鲁肽组、smad3-sirna组和sismad3+利拉鲁肽组。利用real-timert-pcr检测细胞smad2、smad3和runx2的基因表达水平,用westernblot分析技术检测p-smad2、smad2、p-smad3、smad3和runx2的蛋白表达水平,并通过检测alp活性和茜素红染色及半定量法评价细胞的分化程度。2我们进一步应用了wnt/β-catenin信号通路抑制剂dkk-1和pi3k-akt信号通路抑制剂ly294002以确定wnt/β-catenin信号通路和pi3k-akt信号通路在利拉鲁肽对smad2和smad3影响中的作用。结果:1利拉鲁肽上调smad2和smad3的mrna水平,并具有剂量反应关系。2利拉鲁肽可以增加p-smad2、smad2、p-smad2/smad2、p-smad3、smad3和p-smad3/smad3蛋白的表达,并具有剂量反应关系。3通过sismad2或sismad3转染抵消了利拉鲁肽对mc3t3-e1细胞向成骨细胞分化的促进作用。4wnt/β-catenin信号通路阻断剂dkk-1和pi3k-akt信号通路阻断剂ly294002可以抑制利拉鲁肽诱导的smad2和smad3相关蛋白的表达增加。第三部分exendin-4促进前成骨细胞向成骨分化目的:明确不同浓度exendin-4对小鼠前成骨细胞mc3t3-e1向成骨分化的影响。方法:1将普通培养液中培养的mc3t3-e1细胞设置为空白对照组,成骨培养液中培养的mc3t3-e1细胞设置为成骨对照组,成骨干预组中exendin-4浓度分别设为10-9mol/l、10-8mol/l和10-7mol/l。在诱导后3、7、14和21天,利用real-timert-pcr和westernblot分析检测细胞glp-1r的mrna和蛋白表达水平。2检测alp活性和茜素红染色及半定量法评价细胞的分化程度,利用real-timert-pcr和westernblot分析检测细胞runx2和ocn的mrna和蛋白表达水平。结果:1exendin-4可使mc3t3-e1细胞glp-1r的mrna和蛋白表达水平表达升高,且呈剂量依赖性。2mc3t3-e1细胞alp活性和茜素红染色半定量的od值随exendin-4浓度升高而增加。3exendin-4可使mc3t3-e1细胞runx2和ocn的mrna和蛋白表达水平表达升高,且呈剂量依赖性。第四部分exendin-4对前成骨细胞向成骨分化影响的信号通路研究目的:明确hedgehog/gli1信号通路是否参与调控了exendin-4促进mc3t3-e1细胞向成骨分化过程。方法:1利用小干扰rna(smallinterferingrna,sirna)转染技术以沉默gli1的基因表达。取成骨诱导培养条件下的mc3t3-e1细胞分为6组,空白对照组、空载体组、gli1-sirna组、空载体+exendin-4组、gli1-sirna+exendin-4组。利用real-timert-pcr和westernblot分析方法检测空白对照组、空载体组和gli1-sirna组中gli1的表达水平以确认转染效率,并在第7天检测所有组的alp活性和runx2组的表达水平,在第21天进行茜素红染色半定量分析。2应用hedgehog信号通路抑制剂环杷明(cyclopamine)以检测gli1的干扰效率以及阻断效率,并确定hedgehog/gli1信号通路在exendin-4对MC3T3-E1细胞促成骨分化影响中的作用。结果:1 Exendin-4可使MC3T3-E1细胞Hedgehog和Gli1的mRNA和蛋白表达水平表达升高,且呈剂量依赖性。2 SiGli1转染降低了细胞中Gli1的mRNA和蛋白表达水平,并抵消了Exendin-4对MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化的促进作用。3 Hedgehog信号通路抑制剂环杷明抵消了Exendin-4对MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化的促进作用。结论:1利拉鲁肽对MC3T3-E1细胞增殖无显著影响。2 MC3T3-E1细胞细胞质与细胞核中存在GLP-1R,利拉鲁肽可以增加成骨培养基中MC3T3-E1细胞GLP-1R的表达,并具有剂量依赖性。3利拉鲁肽通过Wnt/β-catenin和PI3K-AKT信号通路上调Smad2和Smad3相关蛋白的表达,呈剂量依赖性促进MC3T3-E1细胞向成骨分化。4 Exendin-4可以增加成骨培养基中MC3T3-E1细胞GLP-1R的表达,并通过Hedgehog/Gli1信号通路剂量依赖性促进其向成骨分化。