土槿皮乙酸(Pseudolaric acid B,PAB)是从松科植物金钱松的近根树皮中提取的二萜酸类化合物,目前发现它可以通过诱导周期阻滞和细胞凋亡,在多种肿瘤细胞系中发挥抗癌作用。本研究发现,PAB能诱导人非小细胞肺癌A549细胞有丝分裂灾变,进而导致衰老而非凋亡或坏死。另外,PAB诱导细胞衰老时伴随着葡萄糖利用的增加。因此,本文旨在探究体外实验中,肿瘤抑制与葡萄糖代谢的机制。我们选用三株人非小细胞肺癌细胞系(A549,H460和H1299细胞)进行实验。采用MTT法来评估药物对细胞生长抑制的情况。细胞经PI和荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG染色后,用细胞流式仪分别检测细胞周期分布和葡萄糖摄取能力。荧光显微镜下,通过DAPI染色来确定细胞核形态的变化。使用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色来检测衰老细胞的产生。凋亡、衰老和糖酵解相关的蛋白用Wester blot方法进行验证。通过RNAi-Mate试剂进行p53和p21基因干扰实验,从而抑制这两个蛋白的表达。ATP和乳酸的水平使用商品化的试剂盒进行测定。葡萄糖酵解的过程用2-脱氧葡萄糖(2-DG)进行干扰阻止。不同浓度的PAB(5-80 μM)可以时间和剂量依赖性抑制A549细胞增殖。随PAB(20 μM)作用时间的延长,第一天出现明显的G2/M期阻滞,紧接着第二天诱导有丝分裂灾变,最终在第三、四天进入细胞衰老状态,而不是凋亡或者坏死。使用siRNA方法抑制p53表达后,PAB诱导的A549细胞(p53野生型)衰老减少。PAB诱导细胞衰老的现象在肺癌H460细胞(p53野生型)中也有观测到,但在肺癌H1299细胞(p53缺失型)中却没有类似的结果。另外,本研究还发现,PAB诱导A549细胞衰老过程中会伴有葡萄糖利用能力的增强。当p53或p21的表达被抑制后,A549细胞的葡萄糖摄取和代谢能力都会被减弱,同时提高了 PAB诱导的凋亡比率。同样的,当糖代谢被抑制时,PAB处理的A549细胞更容易出现凋亡现象。在PAB调节葡萄糖利用方面,该药物可以增强H460细胞的糖利用,而降低H1299细胞的糖利用。这与PAB分别诱导H460和H1299细胞衰老和凋亡有关系。综合以上结果,我们得出结论,PAB在体外发挥抗癌活性,主要通过激活p53来诱导人肺癌A549细胞衰老。而衰老的细胞伴随着葡萄糖利用能力的提高,这种增强也是依赖p53功能的,因为当p53受抑制时,会出现凋亡和糖利用的降低。这种现象在H460和H1299细胞中也得到验证。总的来说,本研究揭示了葡萄糖利用、细胞衰老和凋亡之间的关系与机制,葡萄糖代谢水平的高低可以调节衰老与凋亡之间的转换。