肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)对于介导Toll样受体(TLR)/白细胞介素1受体(IL-1R)信号传导以及随后的NF-κB(NuclearfactorκB)和AP-1(activator protein-1，AP-1)的激活至关重要，同时白细胞介素1受体相关激酶4(IRAK4)是先天免疫系统Toll样受体家族信号通路的重要成员之一。因此，本研究以池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)为研究对象，利用池蝶蚌性腺转录组获得池蝶蚌TRAF6基因的部分序列，通过RACE-PCR技术首次获得池蝶蚌TRAF6基因的cDNA全长序列，命名为HsTRAF6，其全长为3945bp，ORF框1965bp，编码654个氨基酸，通过生物信息学分析，预测分子质量为75.04kDa，等电点为6.20，丝氨酸(Ser)含量最高，占9%，色氨酸(Trp)含量最低，占0.9%。对序列结构分析表明，HsTRAF6的N端含有一个RING指结构域(58-115aa)，两个TRAF型的锌指结构域(144-198aa和200-256aa)，典型的线圈(CC，TRAF-N)(454-500aa)和MATH(TRAF-C)结构域(501-651aa)，其二级结构和三级结构符合预测结果。
　　同源比对分析结果显示，发现HsTRAF6与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)的TRAF6同源性高达99.54%，同泥蚶(Tegillarca granosa )、栉孔扇贝(Azumapecten farreri)、青蛤(Cyclina sinensis)、美洲牡蛎(Crassostrea virginica)的TRAF6同源性在45%以上，较于脊椎动物，软体动物的锌指结构域和TRAF-N结构域之间插入了额外的氨基酸。通过比较26个有代表性的物种氨基酸，构建HsTRAF6的NJ系统进化树，系统进化树被分为三类：脊椎动物、软体动物和甲壳动物，池蝶蚌与其他贝类等软体动物聚在一支。
　　为了探究HsTRAF6和免疫应答的关系，采用Realtime-quantitativePCR技术，以PBS刺激为阴性对照，通过脂多糖(LPS)和嗜水气单胞菌刺激，在7个时间点(0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h)对10个组织(血、心、肝胰腺、外套膜、闭壳肌、斧足、性腺、肠和鳃)中HsTRAF6的mRNA表达差异性进行分析。发现HsTRAF6的mRNA在所有组织都有表达，这种广泛的表达模式与很多已经报道的软体动物相似，在鳃和肝胰腺中表达最丰富，这与很多有免疫应答功能的基因在肝胰腺中的表达量较高的结果相一致，在血细胞中表达量最低。在LPS和嗜水气单胞菌刺激下，各组织间表达变化存在差异，说明不同的组织中，TRAF6表达的类型可能不同，但均有显著变化，表明HsTRAF6参与了多种生物过程，在池蝶蚌的免疫应答中发挥了作用。
　　针对HsTRAF6的分子特征以及功能的预测，我们进一步对HsTRAF6和HsIRAK4之间的关系进行了研究。通过构建HsTRAF6-ORF-GST和HsIRAK4-ORF-His重组质粒、原核诱导表达和纯化，进行GSTpull-down，通过SDS-PAGE和westernblot检测研究结果。结果显示HsTRAF6和HsIRAK4不存在直接相互作用关系，表明类似于脊椎动物，在池蝶蚌中IRAK4很可能不会通过C端的结构域和TRAF6结合发生相互作用，很可能存在IRAK1基因或功能类似于IRAK1的基因，IRAK4是作用于IRAK1的上游并使其磷酸化，并与TRAF6形成复合物，导致TRAF6发生低聚作用引发下游反应，最终导致活化的NF-κB进入细胞核，引起促炎细胞因子基因的转录和表达。
　　本次研究主要通过RACE-PCR在池蝶蚌中克隆得到HsTRAF6的cDNA全长序列，进行生物信息学分析发现HsTRAF6具有保守性；LPS和嗜水气单胞杆菌诱导后，HsTRAF6的mRNA表达水平显著上调。同时，GST-pulldown实验证明HsTRAF6不可以和HsIRAK4直接相互作用。上述结果表明，HsTRAF6参与了池蝶蚌的先天免疫应答，并且在组织中呈现差异性表达。同时，在池蝶蚌中首次揭示了HsTRAF6不能直接和HsIRAK4相互作用，在池蝶蚌中类似于脊椎动物，IRAK4是作用于IRAK1的上游并使其磷酸化，并与TRAF6形成复合物，导致TRAF6发生低聚作用引发下游反应。通过以上研究进一步了解MyD88依赖信号通路分子作用机制，比较脊椎与无脊椎动物的TLR信号通路的区别，为池蝶蚌的疾病防御提供新的思路，也为进一步研究无脊椎动物免疫学提供理论依据。