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苹果是世界主要水果之一,在世界果品生产中占有重要地位。西北黄土高原地区是我国最大的苹果生产基地,但该地区降水量少,土壤贫瘠,是制约苹果生产效益的重要因素。长期的干旱胁迫或者营养匮乏会导致叶片的提前衰老,严重影响苹果树体营养,进而影响果实产量和品质。褪黑素是普遍存在于生物体内古老保守的吲哚类小分子物质,具有广谱高效的清除自由基、提高抗氧化系统的能力,改善生物机体对不良环境的适应性。自噬是参与蛋白质和细胞器降解的重要途径,在叶片衰老、营养饥饿和氧化胁迫中发挥着重要的作用。褪黑素在植物中的生物学功能研究还处于起步阶段,苹果自噬基因的发掘和功能研究也鲜有报道。本论文首先研究了外源褪黑素对不同类型苹果叶片衰老的调控作用,从生理学和蛋白质组学层面分析褪黑素延缓叶片衰老的功能;在发现褪黑素调控衰老过程中自噬基因的表达和氧化胁迫下自噬发生的基础上,利用分子生物学手段系统研究了苹果相关自噬基因Md ATG8i和Md ATG3s的功能,揭示了自噬在叶片衰老和营养饥饿条件下重要的生物学作用,为提高苹果叶片生物学功能和抗逆改良提供理论依据。主要研究结果如下:1.外源褪黑素延缓了黑暗诱导的苹果离体叶片衰老。在黑暗诱导的‘金冠’（Malus domestica Borkh.cv.Golden Delicious）苹果成熟叶片离体衰老过程中,外源10 m M褪黑素处理减缓了叶片光系统Ⅱ最大光化学效率（Fv/Fm）的下降和叶绿素的降解,相对抑制了衰老相关基因SAG12和PAO的表达,减少了H2O2含量的积累,提高了抗氧化系统能力,尤其是抗坏血酸-谷胱甘肽循环（As A-GSH cycle）再生能力,进而延缓了黑暗条件下离体叶片的衰老。2.外源褪黑素延缓了干旱诱导的苹果叶片衰老。以‘寒富’（Malus domestica Borkh.cv.Hanfu）苹果两年生盆栽苗为材料,在长期中度干旱胁迫下,向植株根部定期施用100μM褪黑素溶液。结果表明:外源褪黑素处理显著降低了干旱诱导的叶片黄化、叶绿素降解和衰老相关基因SAG12和PAO的表达,减轻了干旱胁迫对光合作用的抑制,维持了较高的叶片光系统Ⅱ的光化学效率,减少了干旱诱导的H2O2的积累,其原因可能是因为褪黑素提高了抗氧化系统中抗氧化物质的含量和抗氧化酶的活性。3.外源褪黑素通过调控能量代谢和蛋白质降解延缓了苹果叶片自然衰老。以平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd.）两年生盆栽苗为材料,研究了根部定期施用100μM褪黑素对叶片自然衰老中能量代谢和蛋白质降解的调控作用。结果表明:长期外源补充100μM褪黑素相对提高了叶片光合速率、光合色素和光合产物（山梨醇、淀粉和蔗糖）含量;延迟了光合产物的降解,使衰老叶片中葡萄糖和果糖的积累降低,抑制了Md HXK1基因表达,进而弱化了触发衰老的糖信号;维持了较高的叶片全氮、可溶性蛋白和Rubisco蛋白含量,其原因可能是褪黑素抑制了自噬途径大部分自噬基因的表达,延缓了蛋白质的降解。蛋白质组数据分析表明,外源褪黑素处理下调了很多在衰老过程中上调的蛋白质,这些差异蛋白主要参与大分子物质的降解和运输等;褪黑素还上调了少量参与氧化胁迫和光合作用的蛋白,显著下调了一些参与基因调控的蛋白,这些蛋白的信息为后续研究褪黑素潜在的生物学功能奠定了基础。4.外源褪黑素预处理拟南芥提高了氧化胁迫下自噬的诱导积累。以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为材料,利用甲基紫精（MV）进行氧化胁迫诱导自噬体,研究了不同褪黑素浓度（0、0.5、5、10、50μM）预处理的拟南芥在氧化胁迫下对自噬体诱导的影响。结果发现,10μM褪黑素预处理显著增加氧化胁迫下自噬体的积累,剧烈上调自噬At ATG8s家族基因的表达,降低了体内氧化蛋白的积累,提高了At APX1和At CATs基因表达,但是并未改变活性氧水平。褪黑素增强的自噬能力可以帮助清除氧化受损的蛋白和细胞器,使伤害程度减轻,这可能是抵抗外界逆境胁迫的第二道防线。5.从‘金冠’苹果叶片中克隆得到了自噬基因ATG8i的同源序列Md ATG8i。该基因位于苹果第13号染色体上,全长1816 bp,开放阅读框（ORF）为357 bp,编码118个氨基酸,Gen Bank登录号为KF438037。该蛋白属于UBQ超家族,具有哺乳动物ATG8蛋白保守的GABARAP结构,还有与自噬蛋白ATG7的预测结合位点。Md ATG8i在根、茎、叶、花、果实和芽等组织中都可以表达,但在衰老叶片中表达最高,其表达响应叶片衰老、氮饥饿处理和氧化胁迫;酵母体内诱导表达Md ATG8i可以互补酵母Atg8突变体atg8在氮饥饿后恢复生长的表型;其亚细胞定位结果表明,该基因定位于细胞核、细胞膜和细胞质中。6.过量表达Md ATG8i的转基因拟南芥表现出提前抽薹、加快叶片衰老、在碳氮饥饿胁迫下耐受性提高等表型;转基因苹果愈伤组织也表现出较好的抵抗碳饥饿的生长能力;过量表达Md ATG8i转基因苹果植株在不同的营养胁迫和氧化胁迫下有较强的耐受性。转基因拟南芥、‘王林’苹果愈伤组织和‘嘎啦’苹果植株在营养胁迫下具有一致的抗性,说明了自噬基因Md ATG8i在营养胁迫下发挥着重要的作用。7.从‘金冠’苹果叶片中克隆得到了自噬基因ATG3的两条同源序列—Md ATG3-1和Md ATG3-2,Gen Bank登录号分别为KF438032和KR024682。两个基因高度同源,ORF都是927 bp,编码308个氨基酸,分别位于苹果第6号和第7号染色体,具有ATG3蛋白保守的AutophagyN,AutophagyactC和AutophagyCterm结构域。Md ATG3-1和Md ATG3-2在各组织中都可以表达,但在衰老叶片中表达最高;基因表达也响应叶片衰老、氮饥饿和氧化胁迫;亚细胞定位显示Md ATG3-1和Md ATG3-2基因在细胞核、细胞膜和细胞质中都有表达,在酵母中的诱导表达都能够互补酵母Atg3突变体atg3在氮饥饿后恢复生长的表型。在酵母体内蛋白Md ATG3-1和Md ATG3-2分别能够与蛋白Md ATG8i相互作用。8.从‘金冠’苹果叶片g DNA中克隆得到了苹果自噬基因Md ATG3-2的启动子（1764bp）,分析了顺式作用元件和启动子的活性;利用酵母单杂交系统筛选出了与Md ATG3-2启动子互作的新基因Md ROATG3。该基因全长1912 bp,ORF为888 bp,编码295个氨基酸,位于苹果第12号染色体上,Gen Bank登录号为XP008389698.1。目前没有已报道的预测保守结构域,属于一个新的未知功能蛋白。Md ROATG3在衰老叶片和果实中表达较高,其表达响应叶片衰老、氮饥饿和氧化胁迫;亚细胞定位结果显示Md ROATG3在细胞核中表达,在酵母中具有转录自激活活性,推测其是一个转录因子;经酵母单杂交和Ch IP-PCR验证,苹果Md ROATG3蛋白能够与自噬基因Md ATG3-2启动子5’端10-120 bp和1-154 bp区域结合。9.过量表达Md ATG3-2和Md ROATG3的转基因拟南芥和‘王林’苹果愈伤组织表现出与Md ATG8i转基因植株一样的生长表型和抗性。同时,过量表达Md ROATG3‘嘎啦’苹果在营养饥饿下的抗性表型与转Md ATG8i基因苹果也是类似的,证明了Md ROATG3基因是通过正调控自噬基因提高植株营养饥饿下的抗性,进一步验证了自噬的功能。此外,转Md ROATG3基因苹果盆栽苗还减轻了干旱胁迫造成的伤害,相对提高了自然干旱胁迫下的抗性。