[研究背景与目的]1971年,Judah Folkman博士和他在美国波士顿儿童医院(Boston Children’s Hospital)的同事首次提出肿瘤生长和转移需要血管生成过程参与的观点,即通过抑制肿瘤的血管生成可以达到治疗肿瘤的目的,这也是国内外学者多年关注的热点。活血化瘀是中医重要的治则,活血化瘀中药可以通过遏制血管生长发挥抗肿瘤作用。丹参作为临床上抗肿瘤治疗应用最多的活血化瘀中药,在中医治疗肿瘤中发挥着重要的作用,而隐丹参酮是丹参中一个主要的抗肿瘤效应成分,最近也有研究表明隐丹参酮还具有潜在的抗血管生成作用,但是其抗血管生成的机理还没有被阐明。本研究目的是基于肿瘤血管生成生物网络调控下,以隐丹参酮作为模版分子,观察其对血管生成作用,并探究其潜在的作用机制,试图为传统中药的抗血管生成和抗肿瘤研究提供一个新的思路和新的视野。[实验内容](1)本研究首先基于已公开发表文献进行回顾式分析,利用网络可视化软件Cytoscape3.0.3建立丹参抗肿瘤网络,寻找丹参中成分抗肿瘤作用的可能靶标；对丹参中主要脂溶性和水溶性成分对TNF-α的分泌影响进行考察,筛选出效应成分隐丹参酮：再利用国家人口与健康科学数据共享平台COREMINE Medical对隐丹参酮、丹参、肿瘤以及血管生成进行文献挖掘,分析全球研究的最新进展；(2)体内利用转基因斑马鱼和小鼠Matrigel plug血管生成模型考察隐丹参酮对血管生成的影响；体外利用小管形成实验和血管出芽实验考察隐丹参酮对血管形成的影响；利用BrdU实验考察隐丹参酮对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞增殖的影响；再利用划痕实验和Transwell迁移实验考察隐丹参酮对HUEVC细胞迁移的影响；(3)在对于隐丹参酮作用环节的探索方面,利用western blot考察HUEVC细胞出芽相关蛋白及TLR4的影响；利用ELISA考察隐丹参酮对HUEVC细胞VEGF分泌的影响；再利用realtime PCR和ELISA考察隐丹参酮对HUEVC细胞TNF-α水平的影响,同时利用western blot考察隐丹参酮对HUEVC细胞TNFRs蛋白表达的影响；(4)在机理分析方面,利用realtime PCR考察隐丹参酮对HUEVC细胞TNF-α mRNA坐衰期的影响；构建包含TNF-α3’UTR的荧光素酶报告基因质粒,检测隐丹参酮对其的影响；利用western blot和免疫荧光考察隐丹参酮对HUEVC细胞HuR蛋白易位的影响；并通过荧光素酶报告基因、western blot和免疫荧光检测隐丹参酮对]1UEVC细胞TNF-α上游信号通路的作用；(5)最后再利用转基因斑马鱼肿瘤模型验证隐丹参酮对肿瘤生长和血管生成的影响。[研究结果](1)文献挖掘的结果显示,INF-α可能是丹参抗肿瘤作用的最显著的靶点,对抗TNF-α可能是丹参抗肿瘤以及抗血管生成的分子基础；化学结构聚类分析隐丹参酮可能是效应成分,以其作为下一步研究的药物；隐丹参酮是否具有抑制血管生成的研究很少,尤其对血管出芽作用的研究则是空白；(2)隐丹参酮在体内外都可以显著抑制LPS或者VEGF诱导的血管的出芽新生和血管形成；在体外隐丹参酮还可以抑制HUVEC细胞的增殖和迁移；(3)隐丹参酮对HUVEC细胞中与血管出芽相关的Notch信号和VEGF的蛋白表达没有明显作用,对HUVEC细胞VEGF的分泌水平也没有明显的影响,并且对LPS的模式识别受体TLR4的表达也没有明显的影响。但是隐丹参酮则可以剂量依赖性地下调HUVEC细胞TNF-α的水平,同时显著抑制TNFR1的表达,却对TNFR2的表达没有明显的影响；(4)为了研究隐丹参酮下调TNF-α表达的机制,我们首先发现LPS可以延长TNF-α mRNA的半衰期,8gM的隐丹参酮可以显著降低TNF-α mRNA的半衰期,甚至低于空白对照组。我们又构建了包含TNF-α3’UTR的荧光素酶报告基因质粒,发现隐丹参酮可以剂量依赖性地抑制TNF-α3’UTR的报告基因活性,还发现隐丹参酮还可以抑制LPS诱导的HuR蛋白的易位,并且这个作用是通过抑制NF-κB的相对启动子转录活性、NF-κB和STAT3信号通路的磷酸化以及NF-κB的入核而实现的,但是对STAT3的相对启动子转录活性以及P38、Akt、Erk等信号通路的磷酸化无明显影响。(5)隐丹参酮可以显著抑制斑马鱼中肿瘤的生长并且可以遏制肿瘤血管的出芽新生。[结论与意义]本研究有以下发现,(1)隐丹参酮在体内可以抑制斑马鱼血管出芽式新生,还可以抑制小鼠Matrigel plug血管生成；隐丹参酮在体外可以抑制HUVEC细胞的小管形成和血管出芽；还可以抑制HUVEC细胞的增殖和迁移；(2)隐丹参酮可以下调HUVEC细胞TNF-α的水平并且可以抑制TNFR1的表达；(3)隐丹参酮下调TNF-α的水平可能是通过抑制HuR调控的TNF-α mRNA稳定性而发挥的,并且这个过程是通过抑制NF-κB和STAT3信号通路实现的；(4)隐丹参酮还可以抑制肿瘤的生长和肿瘤血管新生。该课题为我们阐明了隐丹参酮抗血管生成作用机制,并且也为研究中药抗血管生成和抗肿瘤研究提供了一个新的途径和视野。