家蚕的性别决定在产业上具有很大的应用价值,长久以来,一直是广大学者所关注的研究热点。在模式生物果蝇中,性别决定的关键因素为Sxl的存在与否,当有活性的SXL蛋白时为雌性,无成熟表达的则为雄性。目前,关于Sxl在非果蝇属昆虫是否具有性别决定作用还没有相关报道。在家蚕中,仅对Sxl同源基因进行了序列克隆及表达谱分析,结果显示Sxl在生殖系中高量表达。那么,阐明Sxl在家蚕的性别决定途径中是否发挥着重要作用,对理解家蚕性别决定机制乃至整个昆虫性别网络都具有重要参考意义。本论文对家蚕Sxl同源基因(Bmsxl)在性别决定中的功能进行研究,获得主要结果如下：1.Bmsxl功能域的克隆、原核表达纯化及多克隆抗体制备利用SMART软件,我们预测到了Bmsxl的两个RRM结构域。根据该段序列设计引物,以五龄三天家蚕的精巢cDNA为模板,克隆到675bp长的功能域区域。将该段区域克隆到pET-28a(+)质粒中,构建原核表达载体,将该质粒转化至BL21(DE3)表达菌株中进行表达,经37℃,4h诱导表达出可溶的带有His标签的BmSXL重组蛋白。重组蛋白经过镍柱纯化,在100 mM咪唑浓度下可以洗脱得到较纯的目的蛋白,通过高灵敏度的银染检测,纯度进一步得到了确认,通过BCA检测法测定了洗脱蛋白的浓度,该蛋白在浓度和纯度方面都高度符合制备多克隆抗体的条件。将纯化后的蛋白样品送至南京金斯瑞公司制备兔抗多克隆抗体,制备的抗体效价为1：100000,符合后续实验的需要。2.家蚕Bmsxl对自身的结合利用PCR技术,在家蚕中克隆了Bmsxl的两种形式,Bmsxl-PA,Bmsxl-PB。在果蝇中,Sxl能够结合到自身的一段多聚U序列。通过序列分析,发现在家蚕Bmsxl两种拼接形式的差异区上存在这样一串序列UUUUUUUUUUUU,称polyU序列。我们根据这一序列设计探针,进行了凝胶迁移阻滞实验(EMSA),结果显示在生殖腺总蛋白中存在某种蛋白或者复合物与该串多聚U序列有结合。RNA-免疫沉淀(RNAIP)检测结果进一步表明与该串多聚U序列结合的复合物中存在BmSXL蛋白。为了研究该序列对选择性剪接的影响,我们将该串序列突变为UGUGUGUGUGUG构建到真核表达质粒中,同时构建了含有正常polyU序列的细胞转染载体,将这两种载体分别转染至家蚕BmNs和BmE细胞中,发现在家蚕BmNs细胞中,Bmsxl-PB这种拼接形式消失,而在家蚕BmE细胞中,对照组中仅存在Bmsxl-PA,实验组中没有扩增到任何拼接形式的Bmsxl,根据以上实验结果,我们初步判断Bmsxl确实结合在自身的多聚U序列,并且极有可能通过结合到该序列调控剪接,产生了Bmsxl-PB的形式。以上结果说明Bmsxl通过结合到多聚U序列调控自身的选择性拼接。3.家蚕Bmsxl对Bmdsx的调控作用Bmdsx为家蚕性别决定下游的关键基因,在雌雄中分别产生雌特异mRNA形式BmdsxF和雄特异形式Bmds M。其中BmdsxF为默认的剪接形式,雄特异形式的产生是由于上游剪接阻遏物调控。在家蚕中,序列分析显示,在家蚕Bmdsx第三内含子的下游拼接位点存在一段多聚U序列,本组的其他研究成员以前已经证明了Bmsxl确实对Bmd sx上的这段多聚U序列有结合作用。为了研究Bmsxl是否通过结合这段多聚U序列调控Bmdsx剪接,本研究构建突变poly(U)序列和正常poly(U)序列的Minidsx质粒,并将其转染至卵巢细胞中,发现突变该序列后,在卵巢细胞中出现了Bmdsx的雄特异拼接形式BmdsxM,说明此序列是影响选择性拼接的重要位点,当该位点突变之后,促进剪接的因子不能与之结合,从而BmdsxM这种拼接形式出现。此外,我们合成Bmsxl的RNA双链对雄蚕预蛹进行注射,72h后取材提RNA合成cDNA模板,PCR结果显示在雄蛹中Bmdsx的雌特异拼接形式BmdsxF的量上升,根据这一结果我们推测Bmsxl可能参与了BmdsxM的生成。将干涉Bmsxl的蚕蛹养至化蛾,发现雌雄蛾子的内外生殖腺体在表型上均产生了一定变化。与对照组相比,实验组雄蛾的外生殖腺的锯齿版颜色变浅,体积变小,中间的凹陷趋于缓和,内生殖腺的外膜相连,并未观察到精子的明显变化；而在雌蛾中,其外生殖腺的锯齿版颜色变浅,体积变小,边缘的褶皱处也趋于平缓,这一变化趋势与雄蛾一致,至于内生殖腺此时已发育为输卵管,与对照组相比,实验组的输卵管长度变短,卵的排列形式略显杂乱,其次,单个卵的形状趋于长方体而非正常的椭圆体。以上实验结果显示Bmsxl可以影响家蚕的性性状,在性别决定途径中对Bmdsx的选择性拼接具有调控作用。4.家蚕Bmsxl 对 Bm-nanos的调控作用在果蝇中,Bm-nanos的存在促进了原始生殖细胞的自我更新,SXL蛋白通过结合到Bm-nanos的3’UTR区域的多聚U序列来抑制Bm-nanos表达,阻遏原始生殖细胞生成,使之产生原始生殖细胞的分化。那么在家蚕中Bmsxl是否对Bm-nanos也具有这样的调控作用呢?通过分析家蚕Bm-nanos 3’UTR区域的序列,发现有两段多聚U序列,将这两段分别设计标记生物素的探针,通过与生殖腺细胞质蛋白孵育进行EMSA检测,发现有滞后条带,推测BmSXL蛋白与Bm-nanos的3’UTR上的多聚U序列有结合,进行RNAIP实验,进一步确定与家蚕Bm-nanos的3’UTR区域上的两端多聚U序列结合的物质为BmSXL蛋白。为了探索Bmsxl对Bm-nanos 3’UTR结合后对Bm-nanos的调控作用,我们将3’UTR的全长进行克隆,构建了细胞转染载体Luc-nanos-Wild,同时突变两段多聚U序列,得到突变的细胞转染载体Luc-nanos-Mut。将这两种载体分别与PGL3-Bmsxl-PA共转染到家蚕胚胎细胞BmE中,酶活检测结果显示BmSXL能够抑制家蚕Bm-nanos的表达。这些实验结果说明BmSXL通过结合到家蚕Bm-nanos 3’UTR上的多聚U序列来抑制家蚕Bm-nanos的表达,从而可能进一步调控生殖系的分化。根据以上研究,家蚕BmSxl通过与多聚U序列的结合来调控自身、Bmdsx的选择性拼接以及Bm-nano s的表达。这些研究结果表明Sxl在非果蝇属昆虫性别决定中也发挥着重要作用。