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目的:建立多通道实时荧光PCR熔解曲线分析技术(Melting curve analysis,MCA)快速鉴定临床常见侵袭性真菌。方法:1.设计筛选真菌内转录间隔区(Internal transcribed spacer regions,ITS)通用引物和8种TaqMan探针,优化PCR反应体系及条件,检测真菌菌株及临床常见非真菌病原菌分离株,探讨MCA技术的灵敏度、特异性。2.收集合格痰液样本,对比分析MCA技术与真菌培养方法的真菌检出率,评估MCA技术在侵袭性肺部真菌感染(Invasive pulmoary fungal infections,IPFI)的临床应用价值。对比3种痰液样本液化方法,探讨不同液化方法对MCA技术真菌检出率的影响。3.配置不同浓度的6种临床分离念珠菌菌悬液,制作模拟念珠菌血症样本,通过MCA技术检测鉴定,评估MCA技术在侵袭性念珠菌血症(Invasive candidemia,IC)的临床应用价值。结果:1.白色念珠菌的最低检出浓度和解链温度(Melting temperature,Tm)为0.05pg/μL和66.50℃;光滑念珠菌为0.1pg/μL,66.25℃;热带念珠菌为0.1pg/μL,60.15℃;克柔念珠菌为0.1pg/μL,72.15℃;近平滑念珠为0.2pg/μL,63.10℃;季也蒙念珠菌为0.1pg/μL,61.84℃;新型隐球菌为 0.1pg/μL,65.5℃;黄霉菌为 0.05pg/μL,71.50℃;土曲霉、黑曲霉和烟曲霉为0.05pg/μL,76.80℃。13种临床常见非真菌病原菌如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等熔解曲线分析结果均为阴性。2.164例痰液样本中,MCA技术真菌总检出率为58.5%,白色念珠菌为30.5%,非白色念珠菌为7.8%,曲霉菌为3.7%,混合真菌为16.5%。真菌培养方法真菌总检出率为20.7%,白色念珠菌为17.7%,非白色念珠菌为1.2%,曲霉菌为1.2%,混合真菌为0.6%。59例痰液样本中,4%NaOH液化组真菌总检出率为50.8%,0.1%DTT组为66.1%,1%胰蛋白酶组为62.7%。3.模拟念珠菌血症样本中,模拟白色念珠菌血症样本最低检出浓度为44cfu/mL,光滑念珠菌为73cfu/mL,热带念珠菌为29cfu/mL,近平滑念珠菌为21cfu/mL,克柔念珠菌为71cfu/mL,季也蒙念珠菌为53cfu/mL。结论:1.建立的MCA技术对检测临床常见侵袭性真菌有较高的灵敏度和特异性,可同时检测念珠菌、新型隐球菌、曲霉菌,并能将念珠菌鉴定至种的水平,且与常见的13种非真菌病原菌如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等不发生交叉反应。2.与真菌培养方法相比,MCA技术检测IPFI痰液样本的真菌具有较高的敏感性,方法更为快捷(约3～4h)、方便,可实现对真菌种属的早期鉴定,对非白色念珠菌、混合真菌感染的检测鉴定具有一定的优势,可为IPFI的临床用药治疗方案提供一定的参考依据。0.1%DTT液化方法与1%胰蛋白酶及4%NaOH相比,对提高MCA技术检测真菌的敏感性具有一定的意义。3.MCA技术检测模拟IC样本具有较高灵敏度,其最低检出浓度可达20-80cfu/mL,并可在4～5 h内得出鉴定结果,具有快速,准确且灵敏度高等特点。可为IC的早期诊断及用药治疗提供一定的参考依据。