硫化氢（H2S）是一种新型信号分子,在许多生理过程中发挥重要作用。H2S与硫烷硫（sulfane sulfur）在细胞质中通常共同存在,最近的研究表明H2S发挥信号作用主要以硫烷硫形式实现。与H2S相比,硫烷硫亲核性更强,修饰巯基的能力更强。硫烷硫包括无机多硫化物（HSnH,n≥2）、有机多硫化物（RSSnH和RSSnR,n≥2）和有机过硫化物（RSSH）,是哺乳动物的常见细胞组分,在抗氧化、神经传递、抗炎症和代谢调控等方面发挥重要作用。硫烷硫也广泛存在于微生物中,同样具有重要的生理功能。如在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中,硫烷硫参与细菌致病性的调控;在铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa PAO1）中,硫烷硫浓度和细菌的致病性、耐药性相关;在海洋蓝细菌（Synechococcus sp.PCC7002）中,硫烷硫浓度和细菌的光合作用有关。放线菌被认为是天然产物的重要来源,市场上约70%的抗生素和抗癌药物均来自放线菌的天然产物,其中大多数是聚酮化合物。天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor M145）是一株放线菌的模式菌株,其生长发育过程非常复杂,在此过程中伴随多种次级代谢产物的产生,其中包含多种聚酮类抗生素。目前大多数研究集中在次级代谢产物合成基因簇的解析和挖掘,而对其表达调控的研究较少。本课题旨在探究硫烷硫在S.coelicolorM145（wt）次级代谢产物的合成和分化发育方面上的调控机制。本论文主要研究内容如下:1、硫烷硫促使wt菌株次级代谢产物放线紫红素（actinorhodin,ACT）产量增多、产孢丰富,并识别了一个控制胞内硫烷硫含量的基因簇。对该基因簇进行基因改造可以改变硫烷硫含量,从而影响ACT和孢子的产量。通过向培养基中添加硫氢化钠（NaHS）和升华硫（S8）,发现其诱导wt菌株高产ACT和孢子。过硫化物双加氧酶（persulfide dioxygenase,PDO）能氧化硫烷硫,降低胞内硫烷硫含量。构建敲除株ΔScpdo,发现其内源硫烷硫含量升高,表型分析显示ΔScpdo菌株的ACT和孢子产量增多。通过外源和内源改变硫烷硫含量的方式证明了其可以作为信号分子影响ACT合成和产孢过程。接下来,发现wt中存在一个负责感应和去除过量硫烷硫的基因回路,包含编码CsoR型调控因子（ScCsoR）、过硫化物双加氧酶（ScPDO）、硫氰酸酶（ScRhoD）和亚硫酸盐外排泵（ScTauE）的四个基因。RT-qPCR和EMSA结果显示,ScCsoR直接结合Scpdo启动子区域且负调控其mRNA水平,还能直接抑制自身和Scrhod的转录。RT-PCR表明Scpdo和SctauE属于共转录表达,因此,ScCsoR调控Scpdo、SctauE、SccsoR和Scrhod组成的整个硫烷硫氧化基因回路的表达。鉴定了调控因子ScCsoR能够特异性感应多硫化物。LC-MS/MS分析发现ScCsoR的Cys37能够被硫烷硫过硫化修饰,修饰后的ScCsoR不与启动子结合,从而减弱对Scpdo启动子的抑制作用。通过ΔSccsoR菌株的硫烷硫含量测定和表型分析,发现其硫烷硫含量下降、ACT和孢子产量减少,与ΔScpdo的表型完全相反。因此,硫烷硫的增加促进了 ACT产生和孢子形成。这些结果揭示了细菌中一种用于维持硫烷硫稳态的天然基因回路,确定了硫烷硫能够触发ACT合成,提出了一种激活放线菌中聚酮化合物基因簇的新方法。2、硫烷硫作为信号分子调控AdpA的表达水平,且明确了硫烷硫影响ACT合成的具体路径。ScCsoR不能直接调控ACT合成,因此,还需进一步解析硫烷硫影响ACT的分子机制。那为什么AdpA成为了后续的研究对象呢?第一,我们发现硫烷硫含量最高时AdpA的表达量最大;第二,AdpA直接调控ACT合成（ACT合成的途径特异性激活基因actⅡ-4）和分化发育（wblA和ssgA等）;第三,AdpA含有4个半胱氨酸,为感应硫烷硫提供了可能。表型分析wt、AadpA和ΔadpA::adpA发现,外源半胱氨酸（cysteine）和硫代硫酸盐（thiosulfate）诱导wt和ΔadpA::adpA高产ACT,但不再诱导ΔadpA高产ACT。接下来用400 μM的HSnH和S8处理wt和ΔadpA进行RT-qPCR分析。结果显示,ACT途径特异性激活基因actⅡ-4在wt中的mRNA水平有明显上调,但在AadpA中的mRNA水平不改变。这些结果表明,硫烷硫促进wt高产ACT依赖AdpA。同时,在链霉菌体内构建的荧光报告系统也验证了该结论。为了探究硫烷硫对AdpA及其靶基因的影响,我们进行了一系列的实验。EMSA结果表明硫烷硫影响其与自身、actⅡ-4和wblA启动子DNA的相互作用。同时,RT-qPCR检测ΔadpA中未敲除部分（adpA-wt）的mRNA水平上升,表明AdpA是自抑制因子。在硫烷硫含量相对较高的ΔSpdo菌株中检测到adpA-wt的mRNA水平上升,进一步证明硫烷硫诱导adpA的mRNA水平上升。荧光偏振（Fluorescence Polarization,FP）实验表明,硫烷硫作用于AdpA后减弱与自身、actⅡ-4和wblA启动子DNA的亲和力,证明了硫烷硫是AdpA表达的激活因子。随后,我们构建了数学模型帮助了解硫烷硫如何参与AdpA调控靶基因表达的过程。结果显示,在生长早期胞内硫烷硫含量较高时,被硫烷硫修饰的AdpA含量增多,此时AdpA-S占主要部分,对ActⅡ-4的激活作用较弱;随着胞内硫烷硫含量下降,AdpA-S含量下降,导致AdpA-apo占主要部分,因此对ActⅡ-4的激活作用增强。基于此模型,推测硫烷硫可以暂时打破AdpA表达中的自我抑制作用,使AdpA在更长的时间内积累到更高的水平,最终导致更多的Actll-4蛋白表达,ACT产量增多。这些数据表明,硫烷硫修饰降低了 AdpA对其自身启动子PadpA的亲和力,从而增加了 adpA的表达,进一步促进了其靶基因actⅡ-4和wblA的表达。为了进一步分析AdpA感应硫烷硫的机制,我们将AdpA的四个Cys进行单突变成Ser,回补到ΔadpA中。发现AadpA::adpAC62S菌株的产孢表型没有恢复,证明Cys62对菌株发挥正常生物学功能非常重要。另外,AdpAC62S突变体的EMSA结果显示,其感应硫烷硫的能力明显减弱。FP实验也证明了 AdpAC62S结合DNA的能力受到影响。LC-MS/MS数据表明,硫烷硫在Cys62-SH处形成Cys62-SSH修饰类型。这些结果说明,硫烷硫对AdpA的Cys62过硫化修饰影响其活性。为了进一步揭示该机制,我们利用AlphaFold2预测了 AdpA完整的3D结构。结果显示,Cys62位于蛋白质表面的浅层区,硫烷硫很可能在Cys62-SH处形成Cys62-SSH,该数据为质谱结果提供了理论解释。另外发现高度保守的Cys126位于类似于小分子结合口袋的侧壁上,这个口袋很可能是其他配体小分子的结合位点。进一步分析了 AdpA蛋白不同结构域的保守性,蛋白两端高度柔性且可变,为AdpA与DNA结合的多种模型提供了理论支持。生物信息学分析表明不同的链霉菌中AdpA的四个Cys都很保守,暗示了硫烷硫修饰调控蛋白发挥信号作用可能是一种普遍的机制。本论文首次发现硫烷硫对AdpA进行翻译后修饰调控,并揭示了硫烷硫如何刺激链霉菌中抗生素的产生。3、AdpA还直接调控硫烷硫氧化和还原途径影响其含量,形成了一个闭合反馈的调控回路,是链霉菌应对硫压力和生存的重要因子。AdpA除了调控次级代谢产物合成及分化发育过程外,还能调控硫烷硫含量。研究发现adpA的缺失导致菌株对HSnH和S8的敏感性增强。序列分析和EMSA结果显示,PDO硫烷硫氧化途径和Trx硫烷硫还原系统相关基因的启动子上均含有AdpA的识别序列,表明AdpA直接调控这两条途径。RT-qPCR分析显示,常氧条件下,硫烷硫氧化和还原途径的相关基因在wt菌株中能够显著应答HSnH和S8,而它们在ΔadpA中的应答效果适度减弱;厌氧条件下,硫烷硫氧化和还原基因在ΔadpA中没有诱导效果。这些结果说明,厌氧条件下,AdpA是硫烷硫去除途径的主要激活因子。此外,还发现adpA的缺失导致菌株无法在厌氧条件下生存。因此,本章内容揭示了 AdpA是链霉菌应对硫压力和生存的重要因子,并且发现了 AdpA同时调控硫烷硫氧化和还原途径,形成了一个AdpA感应硫烷硫又能调控硫烷硫含量的闭合调控回路,加深了研究者对微生物硫代谢调控的认识。综上,本论文对活性硫烷硫在天蓝色链霉菌M145中的生理功能进行了探究,揭示了其影响抗生素ACT合成的具体路径,发现了全局性转录因子AdpA感应硫烷硫的同时还能调控硫烷硫含量。研究结果为进一步揭示硫烷硫参与生物体内信号调节作用提供理论依据,也对于激活沉默基因簇和增产聚酮类药物提供了新的契机。