牙囊在牙齿萌出过程中有着至关重要的作用，萌出从本质上来说是发育中的牙齿在牙槽骨中的迁移，其骨内阶段涉及到骨吸收形成萌出通道、根分叉区的骨形成、牙根生长以及基底部骨沉积将萌出中的牙齿移动到萌出通道上，这些事件均由牙囊调控。研究证实牙齿萌出相关分子基因及其产物定位在牙囊中，如CSF-1、c-fos、RUNX2，调控着牙齿萌出所需的成骨-破骨过程。有证据表明成骨细胞特异性转录因子RUNX2在牙囊持续高表达，并在分子层面上调控牙齿的萌出，然而其具体机制仍需要进一步探索。颅骨锁骨发育不良(CCD)是一种少见的遗传性疾病(MM119600)，多为常染色体显性遗传。CCD表现为全身骨骼和牙齿发育不良，口腔表现为乳牙滞留、恒牙迟萌以及多生牙。RUNX2是CCD患者的致病基因，其杂合突变、基因插入、缺失等是造成CCD的重要原因。本研究以RUNX2基因突变对于未萌牙牙囊细胞(human dental folliclecells，HDFC)生物学特性的影响为切入点，通过分析RUNX2基因突变时牙囊细胞生物学特性的改变及对破骨相关基因表达的影响，探讨RUNX2通过调控牙囊内基因的表达而参与牙齿萌出的可能作用。以下从CCD病例的收集、牙囊细胞的分离鉴定及生物学特性的变化三部分简要概括本研究的内容如下。　　 第一章：颅骨锁骨发育不良综合症患者的临床资料收集和突变检测。　　 目的：收集CCD病例，获取RUNX2基因突变患者牙囊组织，为后续实验打下基础。　　 方法：对具有相关临床症状的先证者详细采集病史，明确单发或家族聚集倾向;利用X线检查全面了解患者及其父母的全身骨骼发育情况;详细进行口腔检查，记录恒牙萌出及乳牙迟萌以及埋藏牙、多生牙等典型临床症状;综合上述临床资料，明确诊断。取CCD患者及其姐姐的静脉血，抽提基因组DNA，1％琼脂糖电泳检查抽取的DNA质量，用核酸及蛋白定量仪对其进行定量，PCR扩增RUNX2的序列，纯化PCR产物，进行双向直接测序，对RUNX2基因测序结果进行核酸序列同源性比较分析(Blastn)，分析突变位点;　　 结果：收集到一例CCD患者，具有明显的临床特征，符合临床诊断。RUNX2基因测序结果核酸序列同源性比较分析(Blastn)发现在Exon2上发现插入TG碱基突变，突变型为c.309_310insTG。患者姐姐及父母无明显CCD临床表现，患者姐姐基因组DNA未发现RUNX2突变位点，为散发病例。　　 结论：发现RUNX2基因c.309__310insTG突变位点为该患者的致病基因突变位点，而且该位点为首次检出的新的突变位点。　　 第二章：RUNX2+/m人牙囊细胞的分离培养和鉴定。　　 目的：建立携带RUNX2基因突变位点c.309__310insTG的人牙囊细胞体外培养体系RUNX2+/m HDFC。　　 方法：:选取CCD患者埋伏恒牙的牙囊作为实验组（RUNX2+/m），要求恒牙上方没有滞留乳，牙囊完整;对照组:牙位、年龄、性别与实验组匹配的正常人埋伏恒牙牙囊，牙囊完整。运用组织块法对两组牙囊进行体外原代、传代培养，第3代细胞制备细胞爬片进行波形丝蛋白和角蛋白免疫细胞化学染色鉴定其细胞来源。选取CCD患者(RUNX2+/m)及正常对照组（RUNX2+/+）第3代牙囊细胞(DFCs)，使用Trizol一步法分别提取细胞内总RNA，紫外分光光度计测量所抽提的RNA浓度和纯度，反转录成cDNA，PCR扩增RUNX2序列，测序并行BLAST核酸序列同源性比较分析，验证全血基因组测序结果。取两组细胞cDNA，用SYBR Green实时定量PCR法检测RUNX2基因mRNA表达量，计算相对表达量。裂解两组牙囊细胞，BCA法行总蛋白定量，变性蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，半干法转膜，封闭、杂交，ECL化学发光及图像采集分析，计算灰度值。　　 结果：组织块法成功体外培养人牙囊细胞，细胞呈长梭形、纺锤形、不规则三角形，随着培养时间的增加，细胞增殖呈放射状，实验组和对照组原代牙囊细胞生长状况和形态相似。经差速消化法传代排除上皮细胞的混杂，到第2代时已不见上皮细胞存在。免疫细胞化学检测示两组牙囊细胞波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性。所提取基因组DNA的浓度均约为10μg/ml，大小约20Kb，OD260/OD280＞1.8，获得的基因组DNA的浓度、长度、纯度可以满足PCR反应要求。基因8个外显子的PCR产物经1.2＜琼脂糖凝胶电泳，在Marker的相应大小处均有相应条带。实验组患者的RUNX2基因测序结果核酸序列同源性比较分析(Blastn)发现在Exon2上发现插入TG碱基突变，突变型为c.309__310insTG。该突变导致第104位的谷氨酸GAG(W)移码突变为色氨酸TGG(W)，并在第144位提前产生TAG终止密码子，使RUNX2蛋白翻译中止，引起c端部分氨基酸丢失。实验组体外培养第3代牙囊细胞（RUNX2+/m DFCs）cDNA与正常序列比较，也发现此插入TG突变，与上述全血基因组测序结果相同。结论:RUNX2基因是CCD患者的致病基因，且c.309__310insTG为首次检出，是新的RUNX2基因突变位点。实验组(RUNX2+/m DFCs)的RUNX2基因mRNA表达量为对照组（RUNX2+/+DFCs）的95％。实验组的灰度值较对照组小，RUNX2基因突变牙囊细胞的RUNX2蛋白表达量较正常牙囊细胞下降。　　 结论：成功建立RUNX2+/m HDFC人牙囊细胞体外培养体系，其RUNX2基因转录及蛋白水平的表达明显下降。　　 第三章：RUNX2基因突变对人牙囊细胞生物学特性的影响。　　 目的：探讨RUNX2基因突变对牙囊细胞生长增殖与分化及基因表达的影响。　　 方法：分别制作实验组(RUNX2+/m）和对照组（RUNX2+/+）牙囊细胞第3代、第6代、第9代细胞爬片，常规HE染色，树胶封片，镜下观察细胞形态，采用Image-Pro Plus6.0分析软件计算比较细胞长度、面积。分别取两组第3代、第6代、第9代牙囊细胞，以1000个细胞每孔的密度接种于96孔板，每组4个复孔，MTS法连续7天每天在酶联免疫仪上490 nm波长测各孔光吸收值，绘制生长曲线，比较细胞增殖活性。分别取两组第3代牙囊细胞用成骨诱导液（含β-甘油磷酸钠，维生素C，地塞米松）诱导21天，40 mmol/L、pH值4.0茜素红染色，观察矿化结节形成，10％(w/v)氯化十六烷基吡啶(cetylpyridiniumchloride)共孵育，在酶联免疫仪上562nm波长测光吸收值，作半定量分析，比较细胞矿化能力。分别取两组第3代牙囊细胞用成脂诱导液（含FBS、Penicillin-Streptomycin、Glutamine、Insulin、IBMX、Indomethacin、Dexamethasone)诱导27天，油红O染色，观察脂滴形成，加入异丙醇共孵育，在酶联免疫仪上510nm波长测光吸收值，作半定量分析;抽提成脂诱导后两组细胞总RNA，反转录，SYBR Green实时PCR法检测成脂标志物LPL和PPARγ2的mRNA表达，计算基因相对表达量，比较成脂分化能力。实时定量PCR检测牙囊细胞c-fos、RANKL、OPG的相对表达量。　　 结果：HE染色示，第3代牙囊细胞大多数比较狭长，两极突起较长，核圆，胞浆粉红，胞核蓝染;第6代细胞主要为不规则三角形、多边形，核圆或卵圆形，面积增大;第9代细胞大多形态扁平，突起较细长，核卵圆形，面积明显增大。同一组不同代数细胞，随着体外培养代数的增加，细胞长度增加，面积逐渐增大。与RUNX2+/+DFCs相比，RUNX2+/m DFCs细胞较短，面积较小。RUNX2+/m第3代细胞在接种后第2天开始进入对数生长期，牙囊细胞生长最为迅速，到第5天达到高峰，之后细胞增殖变缓;对照组第3代细胞在第1天即进入对数生长期，生长迅速，到第4天细胞数量达到高峰，之后增殖变缓;两组牙囊细胞增殖活性测量的光密度值差异有统计学意义(p＜0.001)，RUNX2+/m第3代牙囊细胞增殖活性较对照组降低。随着体外培养代数的增加，牙囊细胞增殖活性逐渐减低。成骨诱导21d后，两组体外培养人牙囊细胞均见矿化结节形成，结节中心透光性差，周围细胞呈放射状分布，实验组结节数量较多，形态较大，茜素红染色，结节呈暗红色，中心不透光，实验组第3代细胞茜素红含量显著高于对照组（P＜0.001），说明RUNX2+/m第3代牙囊细胞形成钙化结节能力较强。成脂诱导27天，实验组个别细胞胞质内出现大小不一透亮脂滴，脂滴较大，对照组多数细胞出现亮红色脂滴，以小脂滴为主，脂滴丰富，实验组LPL和PPARγ2的mRNA表达量均较对照组。　　 结论：RUNX2基因突变不同程度改变了牙囊细胞的生长增殖以及向成骨、成脂方向的分化，随着体外培养代数的增加，人牙囊细胞长度增加，体积逐渐变大，增殖活性下降。与正常相比，第3代RUNX2+/m DFCs较短，面积较小，增殖活性较低，成骨分化能力增强，成脂分化能力减弱。RUNX2+/m DFCs表达的RANKL/OPG比值下降，c-fos表达量明显下降。