论文部分内容阅读
糖尿病是全球最严重的流行病之一。胰岛素抵抗是糖尿病发病和进展的关键因素,主要影响胰岛素的代谢调节作用,包括葡萄糖转运,糖原合成和基因表达。越来越多的证据表明,肠道微生物群的变化与胰岛素抵抗和糖尿病有关。黄芪甲苷是黄芪中的重要物质,具有降糖作用。然而,黄芪甲苷是如何通过调节肠道菌群和胰岛素信号通路来发挥降糖作用的机制尚未明确。因此,本实验通过建立体内体外糖尿病模型,从肠道菌群和胰岛素信号通路角度来阐释黄芪甲苷的降糖作用分子机制,以期为糖尿病的防治提供新的思路与策略,具体研究内容如下:小鼠糖尿病(DM)模型的构建及黄芪甲苷保护效果研究:采用高脂高糖喂养联合75 mg/kg链脲佐菌素(STZ)构建DM小鼠模型,检测分析小鼠生理生化指标、氧化应激水平以及组织形态学变化。结果显示,与CON组相比,DM 组小鼠饮水饮食、FBG、OGTT、AUC、HOMA-IR、TG、LDL、MDA水平明显上升(p<0.05);体重、SOD显著下降(p<0.05);肝脏、胰脏组织不同程度损伤。给予不同浓度黄芪甲苷处理后,上述各项指标显著逆转,说明黄芪甲苷能够显著改善DM小鼠损伤。基于AMPK/SIRT1和PI3K/AKT通路研究黄芪甲苷对DM小鼠的保护作用:采用 Western blot 和 RT-PCR 技术分析 AMPK/SIRT1 和 PI3K/AKT 通路蛋白和mRNA的表达情况。结果显示,与CON组相比,DM组小鼠AMPK、SIRT1、PI3K、p-AKT的蛋白和mRNA表达水平显著下调(p<0.05);黄芪甲苷组的AMPK、SIRT1、PI3K、p-AKT的蛋白和mRNA表达水平显著上调(p<0.05)。这提示黄芪甲苷可能通过促进AMPK/SIRT1和PI3K/AKT通路回调,改善氧化应激和胰岛素抵抗,发挥保护DM小鼠的作用。基于宏基因组研究黄芪甲苷对DM小鼠肠道菌群的调节作用:采用宏基因组学对DM小鼠和黄芪甲苷保护小鼠的粪便样品进行检测。结果显示,在门水平上,黄芪甲苷组小鼠肠道中拟杆菌门数量增加,厚壁菌门的相对丰度降低;在属水平上,生产短链脂肪酸的有益菌增加,包括毛螺旋菌、瘤胃球菌属、布劳特氏菌属、丁酸弧菌属、理研菌属、Alistipes等。通过环境因子相关性分析发现,理研菌属、Alistipes、Odoribacter等菌属可上调PI3K/AKT、AMPK/SIRT1通路,改善DM症状。表明黄芪甲苷通过调节肠道菌群的整体平衡,同时影响机体代谢来改善DM。HepG2胰岛素抵抗模型的构建以及黄芪甲苷保护效果研究:用高浓度胰岛素构建IR-HepG2模型,最佳建模条件为1×10-8 mol/L胰岛素刺激下持续48 h时。检测HepG2细胞生化氧化指标,结果显示,与CON组相比,IR组细胞葡萄糖的消耗量显著降低,TG含量显著增加,MDA水平显著增加,SOD活力显著降低(p<0.05);不同浓度黄芪甲苷处理48h后,AST组细胞上述指标明显改善(p<0.05)。说明黄芪甲苷能显著改善IR-HepG2细胞的胰岛素抵抗状态。基于AMPK/SIRT1和PI3K/AKT通路研究黄芪甲苷对IR-HepG2细胞的保护作用:分别采用SIRT1抑制剂和PI3K抑制剂抑制相关通路,采用Western blot和RT-PCR技术分析AMPK/SIRT1和PI3K/AKT代谢通路蛋白和mRNA的表达情况,结果显示,IR组以及SIRT1抑制剂EX527和PI3K抑制剂 LY294002 处理的 IR+EX、IR+LY、AST+EX、AST+LY 组细胞 P-AMPK/AMPK、SIRT1、PI3K、p-AKT/AKT 蛋白表达显著下调(p<0.05),且AMPK、SIRT1、PI3K、AKT的mRNA表达水平也显著下调;黄芪甲苷组 P-AMPK/AMPK、SIRT1、PI3K、p-AKT/AKT 蛋白表达和 AMPK、SIRT1、PI3K、AKT的mRNA表达显著上调(p<0.05)。验证了 IR和DM的发病机制是由于AMPK/SIRT1和PI3K/AKT通路受到抑制进而引起氧化应激,胰岛素抵抗等损伤;黄芪甲苷的保护机制是通过促进上调AMPK/SIRT1和PI3K/AKT蛋白表达,来缓解胰岛素抵抗和氧化应激等损伤。