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γ-氨基丁酸(GABA)是神经系统中一种重要的抑制性神经递质,具有多种生理功能,在医药、功能性食品和饲料添加剂领域有广泛的应用前景。利用微生物生产GABA,是近十年来发酵工程领域的研究热点之一,其中乳酸菌和大肠杆菌(Escherichia coli)是生物合成GABA研究中最常用的菌株。本研究分别从乳酸菌和E.coli出发,通过发酵条件和策略的优化,以及基因工程和代谢工程改造,提高了GABA的产量和生产效率。主要研究结论如下:(1)高产GABA乳酸菌的鉴定及GABA合成条件优化。首先通过16S r DNA测序比对,鉴定本实验室前期从发酵香肠中分离出的可转化谷氨酸钠高产GABA的乳酸菌WPZ001为布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)。而后对发酵条件和培养基成分进行了优化,使L.buchneri WPZ001在摇瓶水平的GABA产量从6.2 g/L提升到75.5 g/L。乳酸菌通常以葡萄糖为碳源,但L.buchneri WPZ001不仅可以利用葡萄糖,也可以利用木糖,且以木糖为碳源时菌株生长更快、GABA合成量更多。结合静置发酵和静息细胞转化工艺,在1 L发酵规模下,以木糖为碳源时,L.buchneri WPZ001细胞以谷氨酸钠为前体累计可合成GABA 129 g;以玉米芯水解液代替木糖作为碳源,GABA累计产量可达117 g。(2)L.buchneri WPZ001中谷氨酸脱羧酶(Gad B)鉴定及活性分析。以L.buchneri NRRL B-30929基因组为模板设计引物,PCR扩增WPZ001基因组中Gad B的编码基因,并进行测序。氨基酸序列比对表明L.buchneri WPZ001 Gad B与L.buchneri NRRL B-30929 Gad B同源性高达99%,但与E.coli W3110的Gad B同源性仅为35%。将L.buchneri WPZ001 Gad B和E.coli W3110 Gad B分别在E.coli BL21(DE3)进行过量表达,发现前者在重组菌中表达时的酶活远低于后者;用镍柱亲和测序纯化两个来源的Gad B并分析酶活性质,发现二者在50℃时催化活性最高,但稳定性较低;L.buchneri WPZ001Gad B和E.coli W3110 Gad B最适p H分别是5.0和4.6。(3)E.coli中分泌表达Gad B高效生产GABA。将Sec分泌系统信号肽基因pel B与双精氨酸分泌系统信号肽基因tor A分别与gad B融合表达在E.coli BL21(DE3)中,发现只有信号肽Tor A能够分泌表达Gad B。通过优化培养基和发酵条件优化E.coli BL21(DE3)/p ET20b-tor A-gad B摇瓶发酵后胞外Gad B酶活达到5.11 U/m L,比优化前提高了2.7倍;采用两阶段甘油流加策略,3 L发酵罐水平,E.coli BL21(DE3)/p ET20b-tor A-gad B胞外Gad B酶活达到13.12 U/m L。E.coli BL21(DE3)/p ET20b-tor A-gad B可通过添加谷氨酸钠生产GABA,分泌表达的Gad B对GABA产量和生产效率的提升发挥了主要作用。摇瓶发酵E.coli BL21(DE3)/p ET20b-tor A-gad B,76 h后GABA产量达228.9 g/L;3 L发酵罐发酵36 h,GABA产量为264.4 g/L,继续延长GABA合成阶段时间至72 h,GABA产量进一步提升至313.1 g/L。(4)构建能利用木糖直接合成GABA的重组E.coli。本研究构建了重组质粒p WZtac-g2,串联表达由tac启动子控制的gad B和谷氨酸脱氢酶基因(gdh A);以及重组质粒p WZt7-g2,串联表达由T7启动子控制的gad B、gdh A和由fts Z启动子控制的T7RNA聚合酶基因。将上述质粒转入不积累GABA的E.coli W3110和E.coli JM109,采用两阶段p H控制发酵策略,重组菌E.coli W3110/p WZtac-g2、E.coli W3110/p WZt7-g2、E.coli JM109/p WZtac-g2和E.coli JM109/p WZt7-g2可直接利用木糖积累GABA0.35-0.52 g/L。E.coli中木糖代谢途径比较复杂,而新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)可通过较简单的Weimberg途径代谢木糖。通过共表达Weimberg途径的5个基因Ccxyl A、Ccxyl B、Ccxyl C、Ccxyl D和Ccxyl X,以及gad B和gdh A,可将木糖合成GABA的过程可简化为7步。本研究构建重组质粒p WZtac-xyl和p WZt7-xyl,分别以tac和T7启动子串联表达Weimberg途径5个基因。将这些质粒转入上述重组菌,得到携带双质粒的重组菌E.coli W3110/p WZtac-g2/p WZtac-xyl、E.coli W3110/p WZt7-g2/p WZt7-xyl、E.coli JM109/p WZtac-g2/p WZtac-xyl和E.coli JM109/p WZt7-g2/p WZt7-xyl。引入C.crescentus Weimberg途径后,E.coli重组菌直接利用木糖合成GABA能力的进一步提升,其中GABA在W3110/p WZt7-g2/p WZt7-xyl中产量达到0.83 g/L。(5)代谢工程改造进一步提高E.coli直接利用木糖合成GABA的效率。为强化Weimberg途径碳流、削弱GABA的降解和增强细胞膜壁通透性,在E.coli W3110和E.coli JM109中逐步敲除waa C、waa F、gab P、gab T、puu E、suc A、xyl A和xyl B八个基因,得到8株突变株;并通过转入质粒对p WZtac-g2/p WZtac-xyl或p WZt7-g2/p WZt7-xyl,在上述突变株中表达以tac表达系统或T7表达系统控制木糖直接合成GABA的七步途径,从而得到16株重组菌。上述菌株中E.coli JWZ08/p WZt7-g2/p WZt7-xyl的GABA产量最高,达到2.47 g/L。为进一步强化Gad B作用,构建了质粒p WZt7-g3将信号肽基因tor A与p WZt7-g2质粒中gad B进行融合,并转入相关突变菌,其中重组菌JWZ08/p WZt7-g3/p WZt7-xyl直接利用木糖合成GABA的能力最强,GABA产量达3.95g/L,是目前文献报道中E.coli直接利用葡萄糖合成GABA的最高产量的3倍。