香蕉枯萎病是破坏维管束导致植株死亡的毁灭性病害。其病原菌是尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum fsp. cubense，FOC)，又称香蕉枯萎病菌。该菌有4个生理小种，1号小种(FOC1)属于世界性分布，主要侵染粉蕉(Musa AAB)，但不能侵染香蕉(Cavendish AAA)；4号小种(FOC4)几乎能侵染所有香蕉种类，如Cavendish和粉蕉等，危害最大。本文通过比较2个小种产生多聚半乳糖醛酸酶(PG)的差异，对FOC4的PG同工酶进行纯化、克隆并进行功能分析。　　 本研究的工作发现，用FOC4接种巴西香蕉或FOC1接种粉蕉，都能检测到PG、PMG、PGTE、PMTE和Cx5种细胞壁降解酶活性，说明FOC可在寄主体内产生多种细胞壁降解酶。经测定，在活体内，PG的活性是最高的，PG可能是FOC的重要致病酶类。观察2个小种在不同培养条件下产生PG的情况发现：在7种不同的碳源培养条件下，有柑桔果胶或PGA存在时，2个小种的PG活性得到明显的诱导。以柑桔果胶作为碳源，改变不同的氮源，在7种氮源培养条件下，FOC1和FOC4均能产生PG活性，但是它们所产生的PG活性比不加氮源所产生的PG活性低。在已有研究的基础上，进一步优化内切酶PGC1的纯化过程。将以1％柑桔果胶为碳源的FOC4培养液经离心和超滤获得的PG粗酶液经过Sephacryl S-100凝胶过滤层析柱以及Sepharose FF CM弱阳离子交换层析柱后，纯化到PGC1。在此基础上，同时得到PGC2～PGC6此5个蛋白。进行SDS-PAGE，为单一条蛋白带，说明PG同工酶已得到纯化，PGC2～PGC6的分子量大小约为63、45、47、35和45kDa。内外切酶活性测定结果表明，PGC5表现出内切酶活性，PGC2、PGC3、PGC4和PGC6为外切酶。　　 本文通过N-末端序列及质谱鉴定的结果，设计简并引物对PGC2～PGC6的基因进行克隆。pgc2～pgc6的DNA序列分别为1589，1622，1728，1131和1898bp；开放阅读框分别为1395，1368，1434，1083和1479bp。在克隆FOC4的pgc2～pgc6同工酶基因后，进一步对FOC1的PG同工酶基因进行同源克隆。2个小种pgc2编码的氨基酸存在2个位点的差异。其中，1个位点是预测的糖基化位点。2个小种pgc3编码的氨基酸存在4个位点的差异。其中，1个位点是预测的糖基化位点，1个位点是预测的N-豆蔻酰化位点。2个小种pgc4编码的氨基酸存在5个位点的差异。其中，2个是预测的N-豆蔻酰化位点。2个小种pgc5编码的氨基酸存在2个位点的差异。其中，1个位点是预测的蛋白激酶C-磷酸化位点。2个小种pgc6编码的氨基酸存在4个位点的差异。其中，1个位点是预测的N-豆蔻酰化位点。将FOC4的pgc1～pgc6基因以及FOC1的pgc2～pgc6基因转化到酵母菌SMD1168中进行异源真核表达。实验表明，这些PG同工酶都能作为功能蛋白被表达出来，FOC1和FOC4此2个小种间的同一个PG经表达后的表达量差异不明显。各个基因表达蛋白都作为融合蛋白进行表达，通过Ni-NTA His亲和结合层析柱获得纯化的蛋白。对重组蛋白的酶学特性测定表明，重组酶PGC1、PGC2和PGC5的最适温度都是50℃，最适pH是5.0；PGC3的最适温度50℃，最适pH是4.5；PGC4的最适温度是55℃，最适pH是4.0；PGC6的最适温度是30℃，最适pH是6.0。　　 本研究通过同源重组的方法构建pgc1～pgc6的敲除载体，并利用ATMT方法进行转化FOC4，成功获得6个PG同工酶的基因缺失突变体。将6个PG基因敲除菌株分别接种香蕉苗，通过Realtime PCR检测，确认敲除的基因在香蕉体内没有表达。观察症状发现除了清水对照外，6个突变体以及FOC4野生菌接种的香蕉苗都出现典型枯萎病症状，但发病的严重程度不一。用FOC4接种的香蕉苗基本上已经枯萎死去。FOC4△pgc2，FOC4△pgc3和FOC4△pgc6接种后的香蕉苗发病也已经严重枯萎，表现得典型的香蕉枯萎病症状。用FOC4△pgc1，FOC4△pgc4和FOC4△pgc5接种的香蕉苗表现出症状明显减轻的情况，仅有少数叶片出现黄化和枯萎，而整株香蕉苗还是生长良好，表明敲除的基因使FOC4的致病力大大减弱。为了进一步验证这pgc1，pgc4和pgc5这3个PG同工酶基因的致病作用，对这3个致病力减弱的突变体菌株进行了功能互补。接种香蕉苗后，3个互补子出现了与野生菌株FOC4类似的枯萎病症状，发病的严重程度没明显的差异。表明此3个基因互补后该菌的致病力得到恢复，说明这3个基因是FOC4对香蕉的重要致病因子。