研究背景与目的2018年全球肺癌的新发病例及死亡病例占恶性肿瘤的百分比分别为13%及18%,居恶性肿瘤的第一位,是最常见的恶性肿瘤之一。肺癌也是我国最常见的恶性肿瘤,肺癌男性癌症中居首位,在女性癌症中居第二位。由于肺癌的高发病率、高病死率,由肺癌导致人群的潜在减寿年数（Potential Years of Life Lost,PYLL）、伤残调整寿命年（Disability Adjusted Life Year,DALY）等疾病负担指标呈上升趋势,直接影响了人群的期望寿命。肺腺癌（Lung Adenocarcinoma,LUAD）占肺癌40%以上,患者预后不佳。因此,研究肺腺癌发生发展的分子作用机制,具有十分重要的意义。非选择性内皮素受体B（Endothelin Receptor type B,EDNRB）基因长度约24kb,位于13q22,包含了7个外显子和6个内含子,其编码的蛋白,即非选择性EDNRB,属于G蛋白偶联的跨膜受体蛋白。在机体中,如心血管系统、胃肠道、肺、肾、肾上腺、子宫、前列腺、脑等血管内皮细胞之中广泛表达。在肿瘤发生发展的过程中,EDNRB基因所在的染色体位点是一个经常出现基因缺失的区域。有研究推测某些肿瘤抑制基因存在于此区域,在肿瘤的发生发展中起到关键作用。迄今为止,EDNRB在肺腺癌中的作用及其分子机制研究报道鲜见。开展“EDNRB基因在肺腺癌中的作用及分子机制研究”的主要目的:分析2013—2017年南京市居民肺癌死亡流行趋势及其疾病负担,同时利用自回归滑动平均混合（Autoregressive Integrated Moving Average,ARIMA）模型对南京市肺癌死亡进行预测分析;基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据分析,建立EDNRB基因在肺腺癌中的分子作用机制,及其影响肺腺癌患者生存的假设;通过肺腺癌患者的临床资料、EDNRB在肺腺癌组织表达,探讨EDNRB对肺腺癌患者生存的影响。通过细胞实验和动物模型,研究EDNRB对肺癌细胞生长、迁移的影响,初步探讨EDNRB对肺腺癌作用的分子机制,及其可能作为分子标志的诊疗价值,为探究肺腺癌新的靶向治疗药物,改善肺腺癌患者结局提供科学依据。研究方法（1）从“中国疾病检测系统死亡监测网络报告数据库”中,获取2013年1月1日至2017年12月31日南京市肺癌死亡人群基本信息;按总人群、性别、年龄分别计算粗死亡率（Crude Death Rate,CDR）;采用2000年全国第5次人口普查性别、年龄的人口数据进行标化;采用Joinpoint软件估算恶性肿瘤死亡率的年度变化百分比（Annual percent change,APC）,分析肺癌死亡趋势;采用疾病分类模型GBD的简略估算方法计算YLL及YLL率;ARIMA时间序列预测模型对南京市肺癌死亡进行预测。（2）在UCSC（http://xena.ucsc.edu/）网站上搜索TCGA数据,根据癌症分类,下载31种癌症的RNA-Seq数据,同时结合Genotype Tissue Expression（GTEx）数据库（https://gtexportal.org/home）中正常组织表达数据,对EDNRB在31种常见癌症和正常组织中的表达情况进行研究。从TCGA数据库中下载肺腺癌病人的相关临床信息数据,包括生存时间、生存状态、年龄、性别、肿瘤分期等。对于缺少预后信息、相关临床信息不全,或者有严重基础疾病的患者进行了筛选和删除,最终获取了996样本进行后续分析。（3）EDNRB基因表达及分组:使用ggpubr R包对31种癌症组织和正常组织中EDNRB的表达情况进行分析。排序前的498例样本为EDNRB基因低表达组,排序后的498例样本EDNRB基因为高表达组。（4）生存分析:通过SPSS 20.0统计软件对获取的差异表达m RNA进行生存分析,使用Kaplan-Meier统计模型估计生存函数。将EDNRB的表达数据结合相关临床资料构建COX风险比例模型,研究EDNRB表达对患者预后的影响。（5）富集分析:以EDNRB在肺腺癌中表达的中位值为标准,将患者划分为EDNRB高表达组和EDNRB低表达组,利用cluster Profiler R包进行EDNRB单基因的基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）。（6）通路分析:利用MSig DB数据库对筛选出的EDNRB的靶基因进行Gene ontology（GO）分析及KEGG数据库的信号通路分析,用Cytoscape＿v.3.0插件Enrichment Map进行GO注释的显著性分析,获得基因集合具有统计学意义的高频率注释、信号转导及疾病通路。（7）肺腺癌患者的临床数据分析:临床资料为2014年1月到2015年12月期间,在东南大学附属中大医院行手术切除收集的168例肺腺癌患者标本及临床信息。标本由经过专业训练的专职人员处理。术后经两名病理学专家进行病理诊断。通过查阅病人的住院病案资料,汇总基本临床数据:如性别、年龄、分化程度、临床分型分期等。排除数据不完整的病例,最终纳入72例。在本次研究中,肺腺癌的分期是基于美国癌症协会（American Joint Committee on Cancer,AJCC）非小细胞肺癌TNM分期第八版。免疫组化(（Immunohistochemistry,IHC）法进行定位、定性和定量的研究,检测肺腺癌患者癌组织EDNRB蛋白表达。以IHC阳性染色细胞占比高低将患者分为EDNRB细胞表达高表达（阳性染色细胞占比>50%）和EDNRB细胞表达低表达（阳性染色细胞占比≤50%）,进行定量数据的比较,选择两组独立样本t检验;定性资料（阳性率）、与患者人口学变量（性别,年龄）及临床特征（肿瘤大小,分化和分期）,分析采用卡方检验。多因素分析采用Logistic回归。运用Kaplan-Meier等统计学方法进行生存曲线分析。以P值<0.05为统计学差异。（8）选择肺癌细胞系H1299、A549、H1650、H23、H460、H520和H466和人正常肺上皮细胞BEAS-2B进行EDNRB的蛋白表达水平上的检测;建立EDNRB过表达细胞模型,Western blot分别检测H1299和H1299/EDNRB克隆、BEAS-2B细胞的EDNRB蛋白表达;采用CCK-8检测EDNRB过表达对肺癌H1299细胞增殖的影响;划痕实验检测EDNRB过表达对肺癌H1299细胞迁移的影响;检测H1299/EDNRB和H1299/Vector蛋白的表达的差异,探究EDNRB是否抑制细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases,Erk）和Akt信号通路的激活,从而影响肺腺癌细胞的迁移和侵袭。（9）小鼠成瘤实验:H1299/Vector、H1299/EDNRB两种细胞株皮下接种Nude小鼠,构建荷瘤模型,评估成瘤情况。研究结果（1）2013年1月1日至2017年12月31日南京市因肺癌死亡的人数为14693,平均每日因肺癌死亡8.05人,其中男性10608人（72.20%）,高于女性（4085,27.80%）;以60岁以上为主（85.12%）,肺癌死亡人群教育程度偏低,其职业大多为农民。肺癌CDR从43.17/10万升高至47.21/10万,APC为2.2%（P<0.001）,呈现逐年升高的趋势;不同年龄段肺癌标化死亡率呈现先升高后降低的过程,男性在70～74岁标化死亡率最高,女性在75～79岁人群标化死亡率最高。（2）5年间南京市居民肺癌YLL为302,078.27人年,YLL率为9.26‰;男性肺癌YLL为218,309.05人年,男性YLL率13.36‰,女性为83769.21人年,女性YLL率为5.14‰;男性YLL率由12.89‰上升至13.80‰（APC%=1.9,P<0.001）,女性YLL率年度变化APC%无统计学差异（APC%=0.4,P=0.7）。（3）通过专家建模及人工调试,最终确定的模型参数为ARIMA（3,1,3）,对模型进行白噪声检验,残差序列ACF和PACF均落在95%CI内;且残差序列Ljung-Box Q检验结果显示无统计学意义（统计量11.54,P=0.644）;综合以上两点认为该模型的残差为白噪声序列,该模型正态化的最小BIC指标值为5.37,平稳R2为0.79,对模型的各个参数进行检验差异有统计学意义（P<0.05）。（4）通过TCGA数据库共筛选996份肺腺癌标本信息。EDNRB在肺腺癌组织中表达为5.09±0.06,低于正常组织（7.74±0.13）（P<0.001）;Kaplan-Meier结果显示,EDNRB表达水平与肺腺癌患者生存曲线呈显著正相关（P=0.034）,即EDNRB高表达的肺腺癌患者可能生存时间相对比较长;对EDNRB基因数据集中所纳入的患者性别、年龄、肿瘤大小、TNM、分期等因素与EDNRB表达的多因素分析的结果显示:临床分期与患者的EDNRB表达有关;GSEA分析显示,Erk和PI3K-Akt通路的调节在TCGA数据中位于前两位,提示EDNRB的表达可能与Erk通路的调控密切相关。（5）在收集的72例临床肺腺癌组织标本中,有15例EDNRB高表达（20.8%）。EDNRB基因表达与肺腺癌患者的临床分期相关（P<0.001）,与性别、年龄、糖尿病、高血压、高血脂、吸烟等因素没有统计学意义。Kaplan-Meier分析显示肺腺癌患者EDNRB表达与生存时间呈显著正相关（P<0.001）。（6）本研究检测7个肺癌细胞系H1299、A549、H1650、H23、H460、H520和H466的EDNRB的蛋白表达。EDNRB的表达量在H1299、H460细胞系中相对最低,在H1650、H520细胞中的表达最高。采用CCK-8检测结果显示,EDNRB过表达组H1299细胞增殖较对照组较低,具有统计学差异（P<0.05）。划痕实验结果显示,EDNRB过表达组H1299细胞迁移-率较对照组细胞迁移率低（P<0.05）。Transwell侵袭实验结果显示,H1299细胞EDNRB过表达组穿膜细胞数量较对照组少（P<0.05）。（7）小鼠成瘤实验结果表明,接种H1299/EDNRB细胞的小鼠皮下肿瘤较H129/Vector小鼠肿瘤体积小。Western Blot实验所示,H1299/EDNRB组的组p-Erk、p-Akt、MMP-9、MMP-2、SMA-a、Slug、N-cadherin蛋白水平明显低于H1299/Vector组;而H1299/EDNRB组ZO1、E-cadherin蛋白水平明显高于H1299/Vector组。研究结论（1）2013年1月1日至2017年12月31日期间,南京市肺癌以男性为主,多为老年人。南京市肺癌标化死亡率基本稳定;不同年龄段肺癌标化死亡率呈现先增加后降低的趋势,不同年龄人群肺癌死亡YLL率呈现增长趋势;ARIMA时间序列预测模型可以用来对肺癌每月死亡人数进行预测。（2）TCGA数据挖掘显示,EDNRB表达与肺腺癌患者的预后相关,EDNRB是肺腺癌的抑癌基因,抑制Erk、Akt减弱癌细胞迁移和侵袭是EDNRB在肺腺癌中作用的分子机制。基于TCGA数据分析可为相关肿瘤的分子机制研究提供了新的线索和新的思路。（3）肺腺癌患者的临床资料分析和IHC实验结果显示,EDNRB在临床肺腺癌患者的癌组织表达、且与肺腺癌生存相关性,与TCGA数据挖掘的结果一致。EDNRB高表达的肺腺癌患者的预后优于低表达患者。（4）EDNRB的过表达的细胞实验,小鼠实验等结果显示,EDNRB是肺腺癌抑癌基因。其作用机制是通过Erk和Akt信号通路影响肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。因此,EDNRB的表达水平作为肺腺癌预后的分子标志具有重要参考价值。