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背景：肾移植已成为终末期肾衰竭有效的临床治疗手段，为移植患者制定有效合理的抗排异免疫抑制方案，对其长期存活率和存活质量有着至关重要的作用。环孢素A(Cyclosporine A, CsA)是器官移植受者普遍应用的免疫抑制剂之一，在临床实践中，我们发现盐酸小檗碱即盐酸黄连素(Berberine chloride, BBR)可显著增加肾移植受者CsA的全血浓度，较大幅度的减少CsA剂量，有望成为节省CsA昂贵费用的手段。围绕这一全新的发现，本课题组已进行了人体内药代动力学实验：即在肾移植受者和健康受试者中进行CsA药代动力学的研究，验证了BBR对CsA的增效作用，且不增加CsA的肝肾毒性；动物实验：BBR及其与CsA合用对大鼠（小鼠)的肝脏(小肠)微粒体酶活性以及CYP3A1、CYP3A2、CYP2E1、CYP1A1及MDR1a和MDR1b基因影响的研究，结果均提示BBR可能通过抑制大鼠（小鼠)肝脏或/和小肠的CYP3A和P-gp的活性或/和表达而增加CsA的生物利用度，间接证明了BBR对CYP3A和P-gp的影响。但BBR对CYP3A和P-gp调控的分子机制仍不清楚，如能通过本研究初步阐明，将有利于最终证实黄连素对CsA的免疫抑制增效作用的确切机制，为黄连素作为免疫抑制增效剂在临床的广泛应用提供实验依据。目的：本课题旨在通过大鼠体内试验，进一步确证黄连素对CYP3A和P-gp的影响；以人肝癌细胞株HepG2细胞为对象研究BBR对CYP3A4和P-gp mRNA水平和蛋白表达的影响；以HepG2细胞为对象研究BBR对CYP3A4和P-gp的上游调控基因PXR和RXR mRNA水平表达的影响，初步探讨BBR对CYP3A4或P-gp的调控是否通过PXR信号通路；为BBR作为CsA的免疫抑制增效剂在临床的广泛应用提供实验依据。方法：1、BBR对大鼠体内咪达唑仑及其代谢物1ˊ-羟基咪达唑仑的药代动力学影响实验。以咪达唑仑作为CYP3A的探针药物，建立大鼠血浆中咪达唑仑和1ˊ-羟基咪达唑仑的HPLC分析检测方法，HPLC法测定各不同给药组大鼠血浆药物浓度，分析比较各给药组BBR对大鼠体内咪达唑仑及其代谢物的药代动力学参数的影响。2、BBR对大鼠体内罗丹明123药代动力学影响实验。以罗丹明123作为P-gp的探针药物，建立大鼠血浆中罗丹明123HPLC分析检测方法，HPLC法测定各不同给药组大鼠血浆药物浓度，分析比较各给药组BBR对大鼠体内罗丹明123代谢的药代动力学参数的影响。3、BBR对HepG2细胞的毒性实验。采用MTT法检测不同浓度的BBR(1-100μg/mL)对HepG2细胞活力的影响，并在BBR对HepG2细胞毒性较小的浓度范围进行实验。4、BBR对HepG2细胞CYP3A4和P-gp蛋白表达影响实验。实验分为空白对照组、不同浓度BBR组、诱导剂利福平（Rif）组以及各不同浓度BBR和Rif共同给药组，与对数期HepG2细胞孵育48h后，提取细胞总蛋白，Westernblotting法检测CYP3A4、P-gp在蛋白水平的表达。考察不同浓度的BBR对HepG2细胞CYP3A4和P-gp蛋白表达水平影响。5、BBR对HepG2细胞CYP3A4、MDR1mRNA以及上游调控基因PXR、RXR mRNA表达的影响实验。根据BBR对HepG2细胞CYP3A4和P-gp蛋白表达影响的实验结果，选取BBR对CYP3A4和P-gp蛋白表达有抑制作用的BBR浓度范围进行实验。实验分为空白对照组、BBR低、中、高剂量组、诱导剂利福平（Rif）组以及各浓度BBR和Rif共同给药组，与对数期HepG2细胞孵育48h后，提取RNA，采用实时荧光定量PCR法（Real-time quantitativePCR，RTQ-PCR）检测CYP3A4、MDR1、PXR、RXR mRNA的表达水平，分析考察CYP3A4、MDR1mRNA的表达与上游调控基因PXR、RXR mRNA表达水平的关联性。6、数据处理与统计分析。所有数据均以平均数±标准差（x±s）表示，采用DAS2.0药代动力学软件分析各组大鼠血药浓度随时间的变化，计算其药代动力学参数，采用SPSS19.0软件进行统计分析，组间差异采用t检验，统计结果以P>0.05表示差异无统计学意义，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示显著性差异。结果：1、建立的大鼠血浆中咪达唑仑及其代谢产物1ˊ-羟基咪达唑仑测定的HPLC检测方法，完全符合咪达唑仑及其代谢产物分析测试的要求；另外建立的大鼠血浆中罗丹明123的HPLC检测方法也完全能够符合罗丹明123大鼠血浆样本分析测试的要求，两种检测方法均具有较高的灵敏度和特异性；适用于本课题评价药物间相互作用的研究，为本课题实施奠定了可靠基础。2、口服不同药物后咪达唑仑的主要药动学参数为：AUC（0-t）(μg/mL·h)分别为：（1.25±0.29）（阴性对照组）、（1.69±0.31）（BBR50mg/kg）、（2.03±0.44）（BBR100mg/kg）、（2.12±0.66）（BBR200mg/kg）、（2.47±0.49）（酮康唑75mg/kg）；Cmax（μg/mL）分别为(1.13±0.25)（阴性对照组）、(1.69±0.23)（BBR50mg/kg）、（1.84±0.29）（BBR100mg/kg）、（2.12±0.53）（BBR200mg/kg）、（2.21±0.29）（酮康唑75mg/kg）。1ˊ-羟基咪达唑仑的主要药动学参数如下：AUC（0-t）(μg/mL·h)分别为：（0.66±0.28）（阴性对照组）、（0.46±0.19）（BBR50mg/kg）、（0.42±0.11）（BBR100mg/kg）、（0.36±0.09）（BBR200mg/kg）、（0.37±0.10）（酮康唑75mg/kg）； Cmax（μg/mL）分别为（0.51±0.16）（阴性对照组）、（0.44±0.13）（BBR50mg/kg）、（0.40±0.08）（BBR100mg/kg）、（0.32±0.07）（BBR200mg/kg）、（0.33±0.09）（酮康唑75mg/kg）。用SPSS19.0进行统计分析，（BBR50、100、200mg/kg）和（酮康唑75mg/kg）均能够显著升高MDZ的AUC（0-t）、AUMC（0-t）、Cmax（P＜0.05），且呈剂量依赖性。（BBR100、200mg/kg）和（酮康唑75mg/kg）能够显著降低1ˊ-OH-MDZ的AUC（0-t）、AUMC（0-t）、Cmax（P＜0.05）且呈剂量依赖性，但（BBR50mg/kg）对1ˊ-羟基咪达唑仑的药动学参数的影响无统计学意义(P>0.05)。3、口服不同药物后罗丹明123的主要药动学参数为：AUC（0-t）(μg/L·h)分别为：（48.36±6.4）（阴性对照组）、（59.58±13.37）（BBR50mg/kg）、（77.51±6.84）（BBR100mg/kg）、（95.49±15.99）（BBR200mg/kg）、（93.01±13.07）（维拉帕米4mg/kg）；Cmax（μg/L）分别为（4.41±0.45）（阴性对照组）、（10.18±5.59）（BBR50mg/kg）、（11.78±3.19）（BBR100mg/kg）、（16.25±8.65）（BBR200mg/kg）、（11.39±2.76）（维拉帕米4mg/kg）。统计分析：（BBR100、200mg/kg）和（维拉帕米4mg/kg）均能够显著升高罗丹明123的AUC（0-t）（P＜0.01）；（BBR50、100、200mg/kg）和（维拉帕米4mg/kg）均能够显著升高罗丹明123的Cmax（P＜0.05）且呈剂量依赖性。4、BBR在1-40μg/mL浓度范围内对HepG2细胞毒性小，细胞活力大于80%，超过40μg/mL时对细胞毒性大，细胞存活率低，以此浓度范围作为本实验的给药浓度更为合理。5、Western blotting结果表明：与空白对照组比较，0.1、0.5和2μg/mLBBR组可使CYP3A4和P-gp蛋白表达增加(P<0.05)，且呈剂量依赖性，但10、40μg/mL BBR组却使CYP3A4和P-gp蛋白表达显著降低(P<0.01)；与空白对照组比较，Rif诱导了CYP3A4和P-gp蛋白表达(P<0.05)，同样与Rif组比较10μg/mL BBR+10μM Rif、40μg/mL BBR+10μM Rif组明显的逆转了Rif对CYP3A4和P-gp蛋白表达的诱导作用，显著降低了CYP3A4和P-gp蛋白的表达(P<0.01)。6、RTQ-PCR结果表明：与空白对照组比较10μg/mL BBR抑制了CYP3A4mRNA的表达(P<0.05)，随着BBR浓度的增加20、40μg/mL则更强地抑制CYP3A4mRNA的表达(P<0.01)，与空白对照组比较10、20、40μg/mL BBR均能显著降低MDR1mRNA的表达(P<0.01)，并且这种抑制作用呈现剂量依赖性；同时与空白对照组比较Rif诱导了CYP3A4、MDR1、PXR、RXR mRNA的表达(P<0.01)；与Rif组比较10μg/mL BBR+10μM Rif、20μg/mL BBR+10μMRif、40μg/mL BBR+10μM Rif组中BBR显著抑制了Rif对CYP3A4、MDR1、PXR、RXR mRNA的诱导作用(P<0.05)，随着BBR浓度的增加抑制作用也越强。结论：本文首先从动物体内水平探明BBR对CYP3A和P-gp的影响，其后从细胞分子生物学水平探索BBR通过PXR信号通路对CYP3A4和P-gp的调控机制。1、结果提示，BBR可以显著抑制咪达唑仑的代谢，该抑制作用可能是BBR抑制了咪达唑仑的代谢酶CYP3A的活性所致。同时BBR也可以显著抑制罗丹明123的代谢，该抑制作用也可能是BBR抑制了罗丹明123的转运体P-gp的活性所致。因此临床上可以把BBR作为提高CsA血药浓度的增效剂使用，减少CsA的给药剂量。2、结果提示，BBR对HepG2细胞CYP3A4和P-gp的蛋白表达有双向调节作用，低剂量时呈诱导作用，高剂量时表现出抑制作用，并且在抑制作用的浓度范围BBR也显著抑制了CYP3A4、MDR1、PXR、RXR mRNA的表达，因此BBR对CYP3A4和P-gp的调控作用很有可能通过PXR信号通路实现。