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促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK/MPK)三级级联途径是植物体内高度保守的信号模块,负责将外界刺激信号逐级放大传递到细胞内部,进而调控植物的生长发育、响应生物以及非生物胁迫等。MAPKKKs位于MAPK三级级联途径的最上游,通过接受上游信号,磷酸化下游的MKK或者直接磷酸化下游靶标而发挥功能。MAPKKK家族庞大,即使在模式植物拟南芥中,由于可能的基因冗余现象,目前只有少部分成员的功能被鉴定过。油菜是中国乃至全世界最重要的油料作物之一,经常受到多种环境胁迫以及病原物的危害。因此,挖掘抗逆基因资源以探索提高其产量以及抗逆、抗病性能,意义重大。在本研究中,我们首先克隆了油菜中MAPKKK家族的部分成员,进行了序列分析并且利用酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)检测了它们与下游多个MKK蛋白的互作,发现了不同于拟南芥中的互作模式。继而,我们发现了BnaMAPKKKx的表达能够调控ROS(reactive oxygen species,ROS)的累积并引起类似超敏反应的细胞坏死。进一步的DAB染色、丙二醛、叶绿素、相对电导率的定量分析以及核内DNA片段化检测等验证了其功能。为了阐明BnaMAPKKKx的作用机理,我们利用BnaMAPKKKx的全长与N末端(BnaMAPKKKxΔC)分别进行了酵母双杂交筛选,鉴定了互作的BnaMKK6/8、BnaMPK6、与糖信号转导/能量代谢相关的的SnRK1.1/1.2(sucrose-nonfermenting related protein kinase 1.1/1.2)以及负调控ABA信号的丝/苏蛋白磷酸酶2类C型(serine/threonine-protein phosphatase 2C,PP2C)家族成员AHG3/PP2CA。然后,利用双分子荧光互补(biomolecular fluorescence complementation,BiFC),对互作的BnaMKK6/8进行了验证。进一步实验发现BnaMAPKKKx能够磷酸化BnaMKK6,但是对于BnaMAPKKKxΔC能否被外界信号刺激后磷酸化而发挥功能,暂时还不清楚,仍然需要深入研究。接着,通过定量RT-PCR分析了ROS稳态平衡以及抗病相关的标志基因的表达变化,结果发现MPKs家族中的NbMEK2、MPK4以及一些ROS相关的RbohB、WRKY33表达量都有上调。继而,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术在烟草中对BnaMAPKKKx的可能下游NbMEK1、NbMEK2、SIPK、WIPK、NTF6、MPK4以及RbohB、WRKY33等进行了沉默。结果发现NbMEK2的沉默能明显缓解BnaMAPKKKx的表达引起的ROS累积,而MPK4的沉默促进了BnaMAPKKKx诱导的ROS累积及细胞死亡。我们进一步通过在拟南芥中调控BnaMAPKKKx的表达来研究该激酶的功能,在获得BnaMAPKKKx的组成型、诱导型过表达转基因拟南芥株系时,发现大部分组成型转基因株系在T1代时就出现了严重的生长停滞表型,无法正常抽薹开花而获得种子。当对诱导型株系进行雌二醇诱导表达后,严重影响了植物的生长发育,特别是导致叶片中ROS高度累积及坏死。而拟南芥直系同源基因的T-DNA插入突变体atmapkkkx的生长状况确实稍优于野生型,表现在子叶偏大,根长稍长。我们的上述研究,不仅有助于全面地了解油菜MAPKKK基因家族的特点,而且,对新发现的调控ROS累积与细胞死亡的BnaMAPKKKx的分子机制的研究,将对提高油菜的抗病性、提高产量与品质,具有重要的理论意义与实践指导价值。