【摘 要】
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猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)主要引起初产母猪的繁殖障碍。PPV除单纯感染猪以外,该病毒与猪圆环病毒(Porcine circovirus Type2,PCV-2)的混合感染更为普遍。这两种传
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猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)主要引起初产母猪的繁殖障碍。PPV除单纯感染猪以外,该病毒与猪圆环病毒(Porcine circovirus Type2,PCV-2)的混合感染更为普遍。这两种传染病在猪场并发或继发感染现象较为普遍,给养猪业造成了巨大的经济损失。猪细小病毒是一种自主复制性DNA病毒,VP2衣壳蛋白是PPV的主要保护性抗原,而且具有很高的保守性。PCV-2基因组位于ORF1内201-220位氨基酸的多肽P21,为一免疫优势T细胞表位,免疫动物后,动物体内的淋巴细胞明显增多,而且免疫动物血清中PCV-2特异的抗体水平亦明显升高,是研制抗原表位疫苗的优势目标表位。本研究选择猪细小病毒VP2基因以及猪圆环病毒2型多肽P21为目的基因,为了制备能够同时预防PPV和PCV-2两种病毒感染的DNA疫苗,本试验构建了共表达VP2基因和P21基因的重组质粒pcDNA-P21-VP2,并用构建的重组质粒进行了小鼠免疫试验,分析了重组质粒诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫反应。本研究对分离的PPV在PK15细胞上进行增殖,根据Genbank报告的NADL-2参考毒株VP2基因的核苷酸序列,利用Primer5.0软件,设计合成一对引物,以PPV病毒的DNA为模板,应用PCR扩增VP2基因片段,将该基因片段克隆到pMD–18T载体,并进行了酶切、PCR鉴定和序列测定。将从pMD-18T-VP2中酶切纯化后的VP2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的BamHⅠ和XhoⅠ之间的多克隆位点上,并在VP2基因的5’端插入用酶促合成方法获得猪圆环病毒2型的T细胞表位基因P21,构建重组质粒pcDNA-P21-VP2。经酶切鉴定,结果表明VP2基因与P21基因均正确插入到载体中。重组质粒pcDNA-P21-VP2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞,使其在真核细胞中进行表达,经SDS-PAGE、Western-blot检测分析表达的重组蛋白。试验结果表明,表达的重组蛋白大小约为67kDa,与预测蛋白大小相符,并且表达的蛋白可被鼠源PPV抗血清与鼠源PCV-2抗血清所识别。采用肌肉注射pcDNA-P21-VP2阳性质粒接种Balb/c小鼠,用ELISA方法进行抗体检测试验, MTT法检测小鼠免疫后脾脏淋巴细胞的增殖活性。构建的pcDNA-P21-VP2质粒能够有效诱导小鼠产生明显的免疫反应,并且对淋巴细胞的增殖反应有明显促进作用。为研制抗PCV-2和PPV核酸疫苗提供了实验依据。
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