【摘 要】
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近年来,免疫抑制剂、广谱抗生素的使用,器官移植等致使侵袭性真菌感染人群逐年上升。由于侵袭性真菌病临床症状不典型、难治愈、死亡率高,引起了医院及病患者的广泛关注。传
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近年来,免疫抑制剂、广谱抗生素的使用,器官移植等致使侵袭性真菌感染人群逐年上升。由于侵袭性真菌病临床症状不典型、难治愈、死亡率高,引起了医院及病患者的广泛关注。传统的诊断方法因耗时长、假阳性结果多的局限性,使病患者不能得到及时的诊断治疗。所以临床急需一种快速有效的诊断侵袭性真菌病的方法,用于侵袭性真菌病的诊断。本课题采用0.05%NEM与0.015%EDTA作抗凝剂,在百万级洁净间进行鲎血细胞的采集、破碎获得了活性较高的鲎血细胞溶解物。此溶解物中含有G因子、凝固酶原等。G因子可特异性的与侵袭性真菌细胞壁标志物1,3-β-D-葡聚糖反应而被激活,活化的G因子使凝固酶原转化为凝固酶,凝固酶水解鲎三肽,释放出对硝基苯胺,使溶液呈为黄色,在405 nm波长处进行检测,以此建立动态比色法定量检测1,3-β-D-葡聚糖含量,进行侵袭性真菌病的诊断。由于反应体系主要成分是蛋白质,长期保存易失活,所以采用真空冷冻干燥技术对检测试剂进行冷冻干燥。为了避免冷冻干燥过程对蛋白质的损害,向冻干制品中加入3.6%甘露醇作为蛋白保护剂和赋形剂进行真空冷冻干燥,冻干效果较好,可在2-8℃条件下长期保存。以0.02mol/LKOH溶液与0.1 mol/LKCl溶液等体积混合作为样本处理液,Cutoff值定为82.15 pg/mL时,对样本进行1,3-β-D-葡聚糖定量检测,其敏感性为94.3%,特异性为81.9%,具有较好的临床诊断价值。因鲎血细胞溶解物中存在内毒素反应通路,所以通过凝胶过滤除去B因子,以示踪蛋白过凝胶柱绘制280 nm吸收峰与溶液流经Superdex200柱体积关系图,以此进行B因子收集并将其除去,从而切断内毒素反应通路。进行含B因子检测主剂和无B因子检测主剂性能对比发现,无B因子检测主剂性能稍好,但是B因子除去比较困难。而含B因子检测主剂的生产制备较易,可广泛应用于生产。
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