论文部分内容阅读
目的：构建针对小鼠ORAI1基因进行RNA干扰从而下调细胞内Orai1蛋白表达的重组慢病毒Lenti-ORAI1-shRNA,并测定重组慢病毒的感染效率与干扰效率。建立Lenti-ORAI1-shRNA感染小鼠鼻腔的体内模型,并测定其对小鼠鼻黏膜中ORAI1基因的转录抑制效率的动态变化；建立Lenti-ORAI1-shRNA气道内干预变应性鼻炎小鼠模型并观察其对鼻炎症状、小鼠鼻腔局部与全身炎症相关免疫细胞功能的影响并初步探寻其机制。材料与方法：针对小鼠ORAI1基因序列设计RNA干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,与经ClaI及MluI双酶切的pLVTHM慢病毒载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA干扰慢病毒表达载体,将pRSV-REV质粒、pMDlg-pRRE粒、pMD2.G与pLVTHM/ORAI1-shDNA重组质粒混合感染293T细胞包装慢病毒并测定病毒滴度。用包装好的Lenti-ORAI1-shRNA感染PANC-1细胞,流式细胞分析测定其感染效率,荧光定量PCR检测其对ORAI1基因的转录抑制效率。将BALB/c小鼠随机分为7组,一组为正常对照组,另外六组为Lenti-ORAI1-shRNA干预组。将干预组小鼠麻醉后,鼻腔滴入8μl0.3%溶血卵磷脂,1小时后鼻腔滴入20μl滴度为1×109tu/ml的Lenti-ORAI1-shRNA进行感染。分别于感染1,3,7,14,21,28天后处死小鼠,测定其鼻黏膜ORAI1mRNA水平。将小鼠随机分为5组：正常对照组(normal),正常小鼠Lenti-ORAI1-shRNA干预组(NLI),变应性鼻炎组(AR),变应性鼻炎小鼠Lenti-GFP干预组(AR-GFP),变应性鼻炎小鼠Lenti-ORAI1-shRNA干预组(AR-LI)。后三组小鼠以).5mg/ml OVA/20mg/ml Al(OH)3溶液腹腔注射3次致敏,40mg/ml OVA鼻腔滴入8次激发建立变应性鼻炎小鼠模型,对NLI组与AR-LI组小鼠于首次鼻腔激发前3天鼻腔滴入20gl滴度为1×109tu／ml的Lenti-ORAI1-shRNA进行干预,对AR-GFP小鼠滴入相同剂量及滴度的Lenti-GFP进行干预。计数各组小鼠末次鼻腔激发后10分钟内喷嚏数及挠鼻数,Real-time RT PCR法测定各组小鼠鼻黏膜及脾脏ORAI1、LTC4S、EAR3、 germline Cε与IL-4mRNA水平,Western Blotting法测定各组小鼠鼻黏膜Orai1、IL-33、IL-17E与TSLP及脾脏Orai1蛋白表达水平,免疫组化法观察各组小鼠鼻黏膜、鼻黏膜相关淋巴与脾脏中Orai1表达分布情况。ELISA法测定各组小鼠鼻腔灌洗液与血清中LTC4、ECP、OVA-IgE与IL-4的浓度。结果：PANC-1细胞经Lenti-ORAI1-shRNA感染后可表达慢病毒所携带的GFP基因而发出绿色荧光,当感染复数为10时,Lenti-ORAI1-shRNA感染PANC-1细胞48小时后感染效率为98.28%,对细胞ORAI1基因的转录抑制效率为90.5%；而用于对照的空载慢病毒在相同条件下感染效率为98.75%,对ORAI1基因的转录抑制效率为-3%。小鼠鼻腔感染Lenti-ORAI1-shRNA后,鼻黏膜ORAI1mRNA水平随感染时间逐渐降低,至第3天时达最低,随后逐渐升高,感染后一月左右Orai1mRNA水平仍低于正常对照组水平。AR-LI组小鼠鼻黏膜与脾脏ORAI1mRNA水平均较AR组下降,其鼻黏膜Orai1蛋白表达水平也低于AR组小鼠,末次鼻腔激发后挠鼻数与喷嚏数较AR组小鼠也都明显减少；AR-GFP组小鼠鼻黏膜与脾脏ORAI1mRNA水平,Orai1表达水平及末次激发后喷嚏数与挠鼻数与AR组小鼠相比均无明显差异。免疫组化结果提示AR-LI组小鼠鼻黏膜上皮层与固有层、鼻黏膜相关淋巴组织、脾脏生发中心等部位Orai1表达均较AR组小鼠减少。AR-LI组小鼠鼻黏膜与脾脏中LTC4S、 EAR3、germline Cε与IL-4的mRNA水平均明显低于AR组小鼠,其鼻腔灌洗液中LTC4、OVA-IgE与IL-4的浓度以及血清中LTC4、ECP、OVA-IgE与IL-4的浓度也均低于AR组小鼠,AR-GFP组小鼠鼻黏膜与脾脏中LTC4S、 EAR3、germline Cε与IL-4的mRNA水平与AR组小鼠无明显差异,其鼻腔灌洗液与血清中LTC4、ECP、OVA-IgE与IL-4的浓度与AR组小鼠也无明显差异。AR组小鼠鼻黏膜中IL-33、IL-17E与TSLP的表达水平均明显高于正常对照组小鼠,AR-LI组小鼠鼻黏膜中IL-33与TSLP的表达水平较AR组有所下降,但IL-17E的表达水平与AR组相比无明显差异。AR-GFP组小鼠鼻黏膜中IL-33、IL-17E与TSLP的表达水平与AR组小鼠相比均无明显差异。结论：成功构建针对ORAI1基因进行RNA干扰的重组慢病毒Lenti-ORAI1-shRNA; Lenti-ORAI1-shRNA能够成功感染PANC-1细胞并有效抑制ORAI1基因的转录水平。Lenti-ORAI1-shRNA鼻腔滴入可成功感染小鼠鼻黏膜细胞,感染后第3天对ORAI1基因的转录抑制效率达到最高。变应性鼻炎小鼠Lenti-ORAI1-shRNA鼻腔干预后可有效下调其鼻黏膜与脾脏中Orai1表达水平,并减轻其鼻炎症状。下调鼻黏膜中Orai1表达不仅可降低变应性鼻炎小鼠鼻黏膜中肥大细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞与Th2细胞中相关炎性介质的转录与释放,也可降低全身如脾脏与血清中上述免疫细胞炎性介质的转录与释放。Lenti-ORAI1-shRNA鼻腔干预对小鼠变应性鼻炎炎症的抑制作用可能与其阻碍了鼻黏膜上皮细胞中IL-33与TSLP蛋白的合成和表达有关