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目的 胃癌是常见恶性肿瘤,是消化系最多发肿瘤。在我国,胃癌的发病率及死亡率均居恶性肿瘤之首。癌的侵袭及转移是癌患者治疗失败的主要原因,大约30%新诊断的实体瘤患者已有临床上可见的转移灶。因此,如何防止及治疗侵袭与转移成为癌治疗研究的焦点之一。 进展期胃癌根治术后腹膜种植性转移约占40-50%,是影响预后的主要原因之一。目前与腹膜转移相关的粘附分子中较为肯定的是CD44和整合素,CD44是一种分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白,主要介导细胞-细胞、细胞-基质之间的粘附,干扰CD44与其配体之间的相互作用,将为抑制肿瘤的生长转移提供新的治疗靶点。反义技术的基本原理是根据碱基互补原则,用人工合成或生物体表达的特定互补的DNA或RNA片断(反义核酸)以抑制或封闭专一靶基因表达的技术。随着研究的不断深入,硫代磷酸二酯寡核苷酸因其具有水溶性、核酶裂解稳定性以及易于大量人工合成的优点,成为目前最成功的第一代寡核苷酸替代物;采用脂质体携带寡核苷酸进入细胞后,可保护其不被核酶降解,使反义寡核苷酸在细胞核的作用时间延长,改变了其在细胞内的分布。本研究针对CD44的基因序列设计一段特异的寡核苷酸,观察高转移细胞系SGC7901用反义寡核苷酸作用后mRNA、蛋白表达水平的变化,继之检测粘附力、侵袭力的变化,透射电镜观察细胞形态学的变化,从而证实反义技术是阻断转移的有效途径。 方法 SGC7901细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养,以Biotin标记的CD44反义寡核耷酸(asODN)配合组织细胞化学方法观察转染后其在细胞内的分布,并用免疫组化的方法检测是否有蛋白表达的变化,然后用脂质体将CD44 asODN转染SGC790二胃癌细胞系,通过RT-PCR、流式细胞术批rt法、聚碳酸酯膜侵袭试验分别测定CD44mRNA和细胞表面C倒蛋白表达及癌细胞粘附力、侵袭力的变化,透射电镜观察超微结构,统计分析采用SPSS10.0软件行配对计量资料t检验。 结 果 l.生物素标记的C侧 asODN转染S皿901细胞3/J’时,未见胞浆及胞核内出现明显变化,6小时才见细胞内出现钱棕色颗粒;2.从免疫组化的结果可以看出转染 36小时后细胞 C倒蛋白表达有所下降;3·RT-PCR结果显示 aSODN组 CD44恨一actinmRNA相对定量比值(0.641。0.084)较对照组(0.894 t 0.120)显著降低门<o.05h4.流式细胞术检测aso*N组平均荧光指数为(2.087 Z o.577)较对照组(5.283。豆.783)明显下降(P<0.05入5.粘附实验表明 asODN组粘附力N.159 t 0.025)较对照组(0.294。0.058)显著下降(P<0.of);6.SSODN组穿透聚碳酸酯膜的细胞数门.5fi.291)较对照组小5.75【1.708)亦有显著降低p<o.01入7.透射电镜观察表明经aso*甘作用后,癌细胞表面伪足和球状突起明显减少,而随机序列寡核着酸(o DN)组上述各指标较对照组无明显变化。 结 论 二.脂质体确实能把硫代磷酸修饰的反义寡核着酸转染人SGC7901细胞。2.CD44反义寡核着酸转染SGC7901 后可降低其mRNA及蛋白表达水平,从而降低其对细胞外基质的粘附和侵袭,效果优于随机序列寡核着酸组。3.对照组及oDN组表面有很多 ·2·微绒毛及球状突起,大小不一,形态各异;asODN组表面微绒毛及球状突起减少,细胞表面较光滑,这也与其相应的功能变化有关。