【摘 要】
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通过里氏木霉转录谱分析(RNA-seq),并结合生物信息学方法,发现了1个具有锌指结构的基因fogl。对这个基因进行敲除(knock-out),分析在不同碳源条件下敲除株的生长情况和纤维素
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通过里氏木霉转录谱分析(RNA-seq),并结合生物信息学方法,发现了1个具有锌指结构的基因fogl。对这个基因进行敲除(knock-out),分析在不同碳源条件下敲除株的生长情况和纤维素酶的表达特性,以期为寻找新的纤维素酶相关蛋白或转录因子提供证据。以里氏木霉T.reesei tu6△ku70作为对照菌株,比较敲除株T.reesei tu6△ku70Afogl和出发菌株的产孢情况,在乳糖和纤维素下的生长情况和纤维素酶活高低。通过SDS-PAGE初步分析敲除株的外分泌蛋白情况。结果显示:与出发菌株相比,fogl敲除株的产孢情况较差;在葡萄糖作为碳源条件下,敲除株与对照株的生长速度相当,没有明显差别,而在乳糖、纤维素诱导条件下,敲除株的菌丝生长速度较快;SDS-PAGE分析表明,在纤维素和乳糖诱导条件下,敲除株发酵液的外分泌蛋白较多;滤纸酶活(FPA)数据显示,在乳糖诱导下,fogl敲除株粗酶液的酶活分别比对照菌株高10.27%,5.29%。综上所述,初步确定锌指蛋白FOG1的敲除能够提高里氏木霉纤维素酶的分泌表达。为进一步研究FOG1的具体作用机理提供帮助,以及纤维素酶高产菌株的改造提供理论基础。从RNA-seq数据筛选到在葡萄糖下的高转录丰度的2个基因cdnal和tefl,分别克隆这2个基因的启动子序列。以pBluescriptIISK(+)为骨架,构建以PcDNAl和Ptefl为启动子,Pleurotus ostreatus漆酶基因poxl为报告基因的表达载体。转化里氏木霉T.reesei RUT-C30,以葡萄糖作为碳源,测定漆酶酶活。结果表明:cDNAl和tefl启动子均能够启动异源基因的组成型表达,且cDNAl启动子显示结果比tefl启动子更为优越。并且到目前为止,在里氏木霉中chbl启动子还是最强的诱导型启动子。
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