随着人们生活水平的提高，糖尿病成为严重影响人们健康的重大疾病之一。目前全世界1.5亿糖尿病患者中有490万人为Ⅰ型糖尿病，在发达国家中Ⅰ型糖尿病的发病率高达人群的0.5％。Ⅰ型糖尿病是由于产生胰岛素的胰岛β细胞特异性被破坏造成的自身免疫性疾病，可以通过注射胰岛素或者服用降糖药物控制糖尿病病情的相对稳定，但是这些治疗措施不能有效预防糖尿病所导致的各种晚期并发症。现在通过胰腺移植和胰岛细胞移植可以根治糖尿病，但是移植后的患者需要进行免疫抑制治疗以缓解排斥反应，而且可用于移植的胰腺和胰岛细胞来源严重不足，从2～3人的供体胰腺中分离得到的胰岛细胞也只能用于一位糖尿病病人的移植治疗。为了克服免疫排斥反应和供体细胞来源不足的问题，科学家们考虑利用干细胞资源来获得具有胰腺β细胞功能的替代细胞，现在被认为颇具前景。 2000年Soria实验室首次报道了可以将小鼠胚胎干细胞诱导分化为分泌胰岛素的细胞，将这些分化而来的细胞移植到糖尿病模型小鼠体内4周后可以使其血糖恢复到正常水平。2001年Lumelsky实验室也报道了相似的研究结果。但由于胚胎干细胞存在形成畸胎瘤的风险，而人的胚胎干细胞同时存在伦理学争议。这些问题限制了胚胎干细胞的应用前景，同时也使得一些具有一定分化潜能的成体干细胞日益受到研究者们的关注。目前已有较多非胰源性成体干细胞或者成体细胞被诱导分化为分泌胰岛素细胞的研究报道，其中包括间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞，成熟肝细胞和脾细胞等。 在众多非胰源性细胞诱导分化为胰腺细胞的研究中，肝干细胞显示了较强的利用价值，可以作为胰腺β细胞的一种替代细胞。在肝源性细胞向胰腺细胞转分化过程中，转录因子胰十二指肠同源盒基因-1(Pancreaticduodenalhomeobox-1，PDX-1)是关键的调控基因之一。2000年Ferber实验室首次报道了将肝细胞转分化为胰腺细胞的研究，他们将表达大鼠PDX-1的重组腺病毒转染至小鼠肝脏后可以诱导肝细胞分泌胰岛素，可使链脲霉素处理的糖尿病模型小鼠的血糖恢复到正常水平。2003年Tosh和Efrat实验室也证实了可以将不同来源的肝源性细胞转分化为胰腺细胞的可能性，但是目前这些实验室的研究都是在非克隆化的混合细胞基础上进行的，未能在克隆细胞水平上验证此类转分化潜能。 本研究采用的单克隆来源的肝原始细胞系(liverepithelialprogenitorcells，LEPCs)，为本试验室从倒千里光碱损伤的小鼠肝脏中建立的肝干细胞系，具有分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞的潜能。通过获得稳定表达PDX-1的克隆化LEPCs细胞系(命名为LEPCsPDX-1)，经体外诱导培养使其转分化为可以分泌胰岛素的细胞，以探索是否可以在克隆化细胞水平上实现肝源性细胞向胰腺细胞的转分化，研究肝源性胰岛素分泌细胞在糖尿病细胞治疗中的可应用性和有效性。 本研究通过克隆小鼠PDX-1基因，构建了表达PDX-1的逆转录病毒载体和稳定表达PDX-1的LEPCsPDX-1细胞系。LEPCs和LEPCsPDX-1细胞通过无血清DMEM高糖培养基培养72小时；然后用含碱性成纤维生长因子、地塞米松、表皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠、脯氨酸、尼克酰胺和转化生长因子-β1和5％FBS的DMEM高糖诱导培养基培养大约3周左右；换为含5％FBS的低糖DMEM培养基培养72小时，然后在无血清DMEM高糖培养基中培养12小时后结束整个诱导过程。在诱导过程中细胞形态发生了明显的变化，在诱导培养基培养的第3天，部分细胞胞体伸出突起；诱导第7天，突起之间相互发生连接；大约第14天时培养的细胞中出现类胰岛状的细胞团；在诱导培养过程中这些类胰岛状细胞团呈逐渐增大趋势。在诱导结束时通过RT-PCR，比较诱导前后细胞基因表达差异。诱导前的LEPCs细胞表达Insulin2，诱导后的细胞表达胰腺内分泌腺的分子标记：PDX-1、NeuroD1及Insulin1(表达极弱)和外分泌腺早期的分子标记P48。诱导前的LEPCsPDX-1细胞表达胰腺内分泌腺的一些分子标记：PDX-1、NeuroD1、Nkx2.2、Nkx6.1、Pax4、Pax6、Isl1、Ngn3和Insulin2;诱导后NeuroD1和Isl1表达水平降低，Nkx2.2、Nkx6.1、Pax4、Pax6、Ngn3未检测到，Insulin2表达增强，并表达Glut2、Insulin1(比LEPCs诱导后细胞表达的Insulin1明显增强)和P48。Gcg、Sst和Nestin诱导前后的细胞中均未检测到。 双硫腙染色实验和免疫细胞化学实验都显示诱导后的细胞可以表达胰岛素；透射电镜观察进一步证实了诱导后的LEPCsPDX-1细胞具有胰腺β细胞的超微结构特征，胞浆中有发达的线粒体和丰富的内质网，出现了许多典型的β细胞分泌颗粒，颗粒内部密度较高的核芯部分和颗粒膜之间有清亮的间隙。诱导后的LEPCs细胞中未观察到具有胰腺β细胞的超微结构特征的细胞。LEPCsPDX-1细胞移植到糖尿病模型小鼠中，初步的试验结果显示其可在一定程度上改善糖尿病小鼠的高糖症状。以上结果显示表达PDX-1的LEPCs细胞诱导后可以转分化为胰腺β细胞。 在本研究过程中，为实时监测和观察LEPCsPDX-1细胞在向胰腺细胞的分化过程，我们将PDX-1启动子驱动的EGFP报告基因报告基因载体和胰岛素启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体转染到LEPCs和LEPCsPDX-1细胞中，为本研究提供了方便有利的工具。 利用本研究采用的体外诱导培养条件，成功实现了将LEPCs诱导分化为β细胞，体内实验证明了诱导后的细胞对糖尿病小鼠有一定的治疗作用。为进一步利用肝干细胞研究糖尿病的细胞治疗提供了重要的实验数据和理论依据。