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背景:目前认为,顺铂耐药的成因除了药物外排、耐药蛋白形成及DNA修复功能增强外,肿瘤细胞还可对顺铂刺激产生一系列维持细胞稳态的适应性反应,如代谢重编程、自噬、氧化应急等,干扰凋亡信号,从而导致肿瘤细胞产生耐药。20世纪20年代,Otto Warburg最先发现了肿瘤细胞中的能量代谢改变,认为在“瓦伯格效应”下肿瘤细胞“抛弃线粒体”更倾向于利用有氧糖酵解满足其能量需求。但随着研究的深入,人们发现作为代谢与凋亡的整合场所,线粒体依据不同的环境条件与细胞需求,通过适应性重构改变细胞进程与功能、维持细胞的平衡与稳态。线粒体虽然拥有其自己的基因组,但是大部分线粒体蛋白是核内编码的。通过这种被称为核向线粒体正向调节机制,两组基因组协同调控线粒体蛋白质稳态,通过线粒体生物合成维持有效的线粒体功能,促使肿瘤细胞免受由化疗药物等应激刺激引起的损伤。因此探究复杂的核-线粒体正向调控系统,对阐明细胞存活的机制以及干扰线粒体功能作为抗癌治疗的新靶点尤为重要。越来越多的研究显示线粒体生物合成与肿瘤凋亡存在联系。PGC1家族(PPARγcoactivator-1 family)成员PGC1α是已知最主要的线粒体生物合成的调节因子。Jennifer Permuth-Wey等人通过对1800多例白种人上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer,EOC)样本与正常人进行分析发现涉及线粒体生物合成的基因差异(尤其是PGC1α、NRF1等基因)与EOC风险最为密切,且过表达PGC1α与EOC不良预后相关。此外,在BRAFV600E突变的黑色素瘤中PGC1α的表达使得上调的氧化磷酸化基因、ATP水平以及线粒体生物合成与获得性BRAF抑制剂耐受同时发生,表明PGC1α可能通过线粒体生物合成抵抗化疗药物作用下的凋亡效应。但是,作为转录辅助激活因子PGC1α可以通过与特异性转录因子相互作用影响线粒体呼吸、氧化应激防御系统以及脂肪酸代谢等多种细胞进程,其所介导的转录调控网络也依赖于细胞所处的实际外环境及代谢状态。由于PGC1α与不同转录因子相互作用所介导的多层级核调控网络可以从不同方面影响肿瘤细胞的存活和死亡,因此明确在化疗药物刺激等外界环境变化下,PGC1α及其介导的线粒体生物合成转录模式相关因子的改变,能够更加全面地验证PGC1α通过上调线粒体生物量与生物合成抵抗肿瘤细胞凋亡效应的可能,完善从分子(信号通路)到细胞器(线粒体功能)到细胞命运(细胞凋亡)三种不同层次间整合调控的整体认知,为揭示肿瘤细胞顺铂耐药机制,寻找有效的治疗靶点提供新的可能。目的:通过研究顺铂作用下卵巢癌耐药细胞线粒体数量、功能变化及PGC1α介导核转录相关因子的改变,明确PGC1α介导的线粒体生物合成在人卵巢癌顺铂耐药中的作用,探讨卵巢癌顺铂耐药的可能机制。方法:以长时间给予顺铂人工诱导产生获得性顺铂耐药的卵巢癌SKOV3/DDP细胞(顺铂半数致死量为30μg/ml)与其亲代SKOV3细胞(顺铂半数致死量为6μg/ml)为研究对象,在对比观察耐药与非耐药细胞对顺铂诱导细胞凋亡差异的基础上,开展如下研究:1、透射电子显微镜观察SKOV3与SKOV3/DDP细胞线粒体数量与体积的差异;RT-PCR检测SKOV3与SKOV3/DDP细胞线粒体基因拷贝数差异;Mitotracker着色线粒体应用流式细胞术检测SKOV3与SKOV3/DDP细胞线粒体数量差异;应用RT-qPCR实验检测SKOV3与SKOV3/DDP细胞线粒体生物合成相关基因表达变化;Western Blot实验检测SKOV3与SKOV3/DDP细胞内线粒体生物合成相关蛋白的表达差异。2、用不同浓度的顺铂处理卵巢癌亲本SKOV3细胞与卵巢癌耐药SKOV3/DDP细胞,作用24 h后,应用MTT试验检测细胞活性;选用SKOV3细胞顺铂半数致死量6μg/ml顺铂作用于SKOV3与SKOV3/DDP细胞24 h后,Hoechst 33342着色细胞核应用扫描共聚焦荧光显微镜观察染色质凝聚;选用6μg/ml顺铂作用于SKOV3与SKOV3/DDP细胞24 h后,应用Western Blot实验检测细胞色素C的释放;选用6μg/ml顺铂作用于SKOV3与SKOV3/DDP细胞不同时间点,应用JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电势的变化。3、选用6μg/ml顺铂作用于SKOV3与SKOV3/DDP细胞,荧光线粒体指示剂Mitotracker孵育细胞,应用激光共聚焦显微镜与流式细胞术分别检测细胞内线粒体数量变化;选用6μg/ml顺铂作用于SKOV3与SKOV3/DDP细胞,应用RT-qPCR检测线粒体基因拷贝数的变化;选用6μg/ml顺铂作用于SKOV3与SKOV3/DDP细胞,应用荧光探针法检测细胞胞外耗氧率。4、选用6μg/ml顺铂作用于SKOV3/DDP细胞3 h、6 h、12 h与24 h,应用RT-qPCR实验检测线粒体生物合成相关基因表达变化;选用6μg/ml顺铂作用于SKOV3/DDP细胞3 h、6 h、12 h与24 h,应用Western Blot实验检测线粒体生物合成相关蛋白表达变化。5、shRNA敲减SKOV3/DDP细胞内的PGC1α,应用RT-qPCR检测线粒体基因拷贝数的变化;应用RT-qPCR实验检测线粒体生物合成相关基因表达变化;应用Western Blot实验检测线粒体生物合成相关蛋白表达变化;应用荧光探针法检测细胞胞外耗氧率。6、shRNA敲减SKOV3/DDP细胞内的PGC1α后,应用Western Blot实验检测细胞色素C的释放;应用Western Blot实验检测凋亡相关蛋白变化。7、shRNA敲减SKOV3/DDP细胞内的PGC1α后给予顺铂刺激,MTT试验检测细胞活性;Hoechst 33342着色细胞核应用扫描共聚焦荧光显微镜观察染色质凝聚;Mitotracker着色线粒体应用激光共聚焦显微镜观察线粒体数量变化;应用荧光探针法检测细胞胞外耗氧率。结果:1、顺铂作用于SKOV3细胞,线粒体膜电势下降、染色质凝聚、细胞色素C释放,表明线粒体途径凋亡的发生,而顺铂对SKOV3/DDP细胞无上述杀伤效应。2、相较于SKOV3细胞,SKOV3/DDP细胞线粒体数量/体积更大,相对线粒体基因拷贝数更高,线粒体生物合成相关基因及蛋白的水平更高,表明SKOV3/DDP细胞中具有更高的线粒体生物合成水平。3、顺铂作用下调了SKOV3细胞的线粒体基因拷贝数,减低了线粒体功能;而顺铂作用上调了SKOV3/DDP细胞线粒体基因拷贝数,激活了PGC1α及其介导的线粒体生物合成相关通路,线粒体数量与线粒体功能也随之增强。4、敲减SKOV3/DDP细胞内PGC1α表达后,线粒体基因拷贝数减少,线粒体数量减少,PGC1α介导的线粒体生物合成信号通路下调,线粒体呼吸功能降低,细胞对顺铂敏感性增加,凋亡发生;结论:综上可知,顺铂上调了卵巢癌顺铂耐药SKVO3/DDP细胞PGC1α的表达,激活了PGC1α介导的线粒体生物合成,维持了有效的线粒数量及功能,在稳定线粒体膜完整性的前提下增加了线粒体抗凋亡的能力。我们认为PGC1α介导的线粒体生物合成通过正向调控激活了卵巢癌耐药细胞适应性线粒体重构,从分子至细胞器多层级调控线粒体数量及功能来抵抗顺铂诱导的细胞死亡效应,表明PGC1α介导的线粒体生物合成参与了卵巢癌顺铂耐受,可能是改变肿瘤细胞化疗药物耐受的潜在有效靶点。