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脂肪源性干细胞（Adipose stem cells，ADSCs）是一类可以从成熟脂肪组织中提取的成体干细胞，可以分化为其它类型细胞，相比于胚胎干细胞和骨髓干细胞具有取材简便、免疫原性低、没有伦理学问题等优势，可以作为优良的种子细胞，为器官移植与再生、组织缺损修复、美容美体以及多种疾病治疗提供安全有效的解决方案。目前ADSCs在临床治疗应用过程中还存在一些问题，比如患处微环境往往缺氧缺血，pH及离子浓度不适于细胞生存等，极大的限制了细胞移植后的修复效率。近年来微小RNA（microRNA）的研究，提高了人们对细胞转录后水平调控的理解，同时也为疾病的治疗带来新的希望。miR-21是众多microRNA中的一种，与细胞的增殖、分化、凋亡等方面有关，许多研究报道在多种类型细胞中miR-21可以提高其抗凋亡能力，有关miR-21是否能提高大鼠ADSCs抗凋亡能力尚未见报道。本试验提取分离并鉴定大鼠ADSCs，使用H2O2建立体外细胞凋亡模型，检测miR-21对大鼠ADSCs凋亡的影响，并进一步探究miR-21发挥作用的下游靶基因及相关信号通路，以期为今后ADSCs更好的应用于临床治疗提供理论依据。本试验分为三个部分： （1）大鼠ADSCs凋亡模型的建立 取2~3周龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织，经剪碎消化等步骤后培养分离出来的细胞，待细胞长至第3代，进行诱导分化。成脂诱导剂诱导后细胞内出现脂滴，使用油红O染料可以染成红色；成骨诱导剂诱导后细胞经茜素红染色出现黑色钙化结节，说明采用本实验室的分离培养方法可以成功培养出具有多向分化能力的大鼠ADSCs。 使用含不同浓度H2O2（0、50、100、150、200和500μmol/L）的培养基诱导细胞凋亡，固定诱导时间为4 h。使用CCK-8试剂检测细胞活力，当H2O2浓度为200μmol/L后，细胞生存率为49.2 ± 6.06%，与对照组相比发生显著下降（P<0.05），浓度为500μmol/L时，细胞生存率只有19%，细胞死亡量较大。Hoechst33258 染色观察结果与流式细胞术检测结果显示，200 μmol/L浓度的H2O2诱导大鼠ADSCs 发生大约一半的凋亡较为适合后续试验的开展。200μmol/L H2O2组细胞促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8和Bax的mRNA表达量出现显著上升，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达量出现显著下降（P＜0.05）。根据各项试验结果，本试验确定凋亡模型中H2O2的浓度为200μmol/L。 （2）MiR-21对大鼠ADSCs凋亡的影响 应用qRT-PCR方法检测大鼠ADSCs凋亡发生时miR-21的表达量，试验结果显示，凋亡状态下的细胞中miR-21的表达量显著下降（P＜0.05）。用miR-21 mimics 转染大鼠ADSCs ，使大鼠ADSCs 过表达miR-21 后用200μmol/L H2O2作用4 h ，检测细胞的凋亡情况。Hoechst33258 染色结果表明miR-21 mimics+200μmol/LH2O2组的凋亡率与miR-21 scramble+200μmol/LH2O2相比显著减少了69.7%。流式细胞术结果显示与Normal+H2O2 组相比MiR-21mimics+H2O2组凋亡早期凋亡与晚期凋亡率同样显著下降了69.7%。WB试验检测凋亡相关蛋白表达量的结果显示，诱导凋亡组细胞中Caspase-3和Bax蛋白的表达量显著提高，Bcl-2蛋白的表达量显著；miR-21 mimics+H2O2组与诱导凋亡组相比Caspase-3和Bax蛋白表达量显著降低，Bcl-2蛋白的表达量显著升高。各项试验指标均表明过表达miR-21后可以提高大鼠ADSCs抗凋亡的能力。 （3）MiR-21对大鼠ADSCs凋亡影响的分子机制 为了阐明miR-21发挥抗凋亡作用的分子机制，本章节试验首先检测了过表达miR-21后PDCD4和PTEN基因的mRNA及蛋白表达量，qRT-PCR和WB试验结果显示，PDCD4和PTEN的mRNA表达量没有明显变化，但PDCD4和PTEN的蛋白表达量出现了显著的下降（P＜0.05) ，使用PDCD4 siRNA 和Phen分别阻断PDCD4和PTEN基因的转录后，PDCD4和PTEN蛋白的表达量显著下降（P＜0.05），使细胞产生了与miR-21 mimics组相似的显著抗凋亡能力，在一定程度上表明miR-21 在转录后水平抑制PDCD4和PTEN蛋白的表达，即大鼠ADSCs中PDCD4和PTEN是miR-21的下游靶基因。接下来本试验检测了PI3K/AKT信号通路中p-AKT的表达量，在过表达miR-21组和PDCD4 siRNA及Phen组中p-AKT蛋白表达量显著升高，加入PI3K阻断剂LY294002后miR-21的抗凋亡作用被部分逆转，试验结果说明了miR-21-PDCD4/PTEN-PI3K-AKT信号通路影响大鼠ADSCs凋亡的发生。