γδT细胞是一群不同于αβT细胞的T淋巴细胞,其表面表达由γ链和δ链组成的T细胞受体(T cell receptor, TCR),以主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex, MHC)非限制的方式直接识别并结合抗原分子,在机体抗感染、组织损伤修复及抗肿瘤的天然免疫和适应性免疫应答中发挥着重要的免疫监视及免疫调节作用,被认为是联系天然免疫与适应性免疫的重要桥梁。γδT细胞可通过分泌干扰素(Interferon, IFN)-γ、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)-α、穿孔素-颗粒酶等途径,杀伤上皮组织来源的多种肿瘤细胞,参与人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)、Epstein-barr病毒(Epstein-barr virus,EBV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)等多种病毒感染的免疫监视过程。白细胞介素-4(IL-4)是具有多种生物学功能的细胞因子,其经典的作用包括刺激B细胞、促使B细胞向浆细胞分化以及诱导B细胞分泌IgE;促使T辅助(Th)细胞向Th2型细胞分化,并抑制Th1型细胞产生。IL-4也是肿瘤免疫中的关键细胞因子之一。尽管早期认为IL-4具有促使机体消除肿瘤的作用,然而更多的研究表明IL-4可能更倾向于抑制机体抗肿瘤的作用。本实验室长期致力于γδT细胞的研究工作,在实验过程中观察到IL-4对于γδT细胞的活化和增殖具有一定的调节作用。因此,本研究试图阐明IL-4和γδT细胞免疫功能之间的联系,从而揭示IL-4在γδT细胞抗肿瘤中的作用机制。本论文第一部分观察了IL-4对Vδ1T细胞或Vδ2T细胞活化的影响,以及IL-4对γδT细胞活化后增殖的影响。实验中采用固相化抗Vδ1抗体特异性活化初始Vδ1T细胞,或用帕米磷酸钠或唑来膦酸钠特异性活化初始Vδ2T细胞,在培养过程中,观察IL-4对Vδ1或Vδ2T细胞活化的影响。流式分析结果表明,IL-4不仅能显著抑制抗Vδ1抗体引起的Vδ1T细胞活化,也能抑制帕米磷酸钠引起的Vδ2T细胞活化。然而,当将已活化的YδT细胞继续培养时,我们发现IL-4能促进已经活化的Vδ1或Vδ2T细胞的增殖。因此,这部分实验结果表明,初始γδT细胞在接受TCR信号刺激时如果同时接受IL-4的作用,γδ T细胞的活化将受到抑制；而已经活化的γδT细胞在接受IL-4的作用时,IL-4能促进其增殖。随后,我们对上述实验现象的作用机制进行了研究。通过与IL-13比较,我们确定IL-4主要通过Ⅰ型IL-4受体发挥作用。通过细胞核内信号分子染色观察到IL-4作用于静息γδT细胞后不仅促使Stat6磷酸化,也促使Stat5磷酸化。这与已知IL-4Rα1介导Stat6磷酸化以及IL-2(γc链)介导Stat5磷酸化的文献报道结果相一致。另一方面,静息γδT细胞在接受TCR活化信号刺激时,能迅速引起SLP76、PLCγ1和Erkl/2的磷酸化以及Ca2+释放,而IL-4则能明显抑制TCR信号通路中关键信号分子SLP76、PLCγ1和Erkl/2的磷酸化以及Ca2+水平,从而抑制TCR活化引起的γδT细胞信号传导。上述结果表明,IL-4可抑制γδT细胞活化。为了验证IL-4是否通过活化Stat6抑制TCR活化信号,我们采用RNA干扰技术敲低γδT细胞内的Stat6表达,进而采用Phosflow方法观察Stat6-γδ T细胞在接受TCR信号时上述信号分子SLP76、 PLCγ1和Erkl/2的磷酸化水平,并采用激光共聚焦显微技术观察胞内Ca2+变化。结果表明,γδT细胞在敲低Stat6后,IL-4抑制γδT细胞SLP76、PLCyl和Erk1/2磷酸化和Ca2+释放的作用均减弱。为了验证IL-4通过活化Stat6促进γδT细胞增殖的作用,我们同样观察了Stat6-γδT细胞在IL-4作用条件下的增殖情况。实验结果表明,IL-4促进活化γδT细胞增殖的作用因Stat6表达被敲低而被阻断。在第二部分研究中我们在体外采用抗TCR pan γδ抗体同时活化Vδ1和Vδ2T细胞,进一步观察了IL-4的作用。结果表明,在采用抗TCR pan γδ抗体同时活化Vδ1T和V62T细胞时,IL-4可以造成Vδ1T细胞和Vδ2T细胞之间的比例失衡,向Vδ1T细胞偏倚。这与之前IL-4单独作用于Vδ2T细胞时促使其增殖的实验现象相矛盾。为了解释这一现象,我们首先观察了V61T细胞是否对Vδ2T细胞具有抑制作用。Transwell结果表明,Vδ1T细胞确实对Vδ2T细胞的增殖具有抑制作用,并且这种抑制作用不依赖于细胞间的直接接触,而是通过可以透过0.4μm隔膜的可溶性因子实现的。为了探明是何种因子发挥了抑制作用,我们在上述实验体系中分别加入了IL-4、IL-10、IL-13和TGF-β的阻断抗体。实验结果表明在加入抗IL-10抗体时能阻断IL-4促进γδT细胞向Vδ1T细胞偏倚的作用,而抗IL-13或抗TGF-β抗体无此作用。随后的实验发现IL-10具有直接抑制Vδ2T细胞活化和增殖的作用,而对于Vδ1T细胞则作用较弱。为了验证Vδ1T细胞是抑制性细胞因子IL-10的主要来源,我们通过磁珠分选技术分离获得Vδ1和Vδ2T细胞,对两类细胞在活化前和活化后的IL-10分泌水平进行分析,并对两类细胞进行胞内染色。结果表明,Vδ1T细胞在活化后分泌高水平的IL-10,而Vδ2T细胞的IL-10分泌量极低。通过流式技术进行胞内染色的结果同样提示,Vδl T细胞胞内表达有IL-10,而在Vδ2T细胞中则未检测到IL-10。此外,研究中发现IL-4能诱导活化的Vδ2T细胞进一步表达IL-10受体CD210,而作用于活化的Vδ1T细胞时,CD210表达则无明显变化。同时IL-4促使活化的Vδ1T细胞表达IL-4受体CD124,而作用于Vδ2T细胞时,CD124表达无明显变化。这些数据提示,IL-4导致γδT细胞向Vδ1T细胞偏倚的原因可能是由Vδ1T细胞分泌的IL-10所致。为了观察γδT细胞向Vδ1T细胞偏倚带来的生物学意义,我们通过磁珠分选技术分离获得了Vδ1T细胞和Vδ2T细胞,对两类细胞在活化前和活化后的表面分子、细胞因子和转录因子进行分析,并对这两类细胞的杀伤功能进行了研究。结果表明,Vδ1T细胞和Vδ2T细胞的细胞因子分泌谱存在明显差异。在检测的10种细胞因子中,其中包括了Th1、Th2、Th17特异性细胞因子,Vδ1T细胞在活化后除了分泌高水平的IL-10以外,仅分泌少量IFNγ(约400pg/mL)和TNFa(约70pg/mL),其他细胞因子则均低于检测限。而Vδ2T细胞在活化后分泌高水平的IFNγ(3ng/mL)和TNFα(约600pg/mL),以及一定量的IL-4(90pg/mL)和IL-5(300pg/mL)。在细胞表型方面,Vδ2T细胞在活化后均表达杀伤性NKG2D,而Vδ1T细胞在活化时部分细胞不表达NKG2D,并且IL-4能明显抑制Vδ1T细胞NKG2D的表达。为了确定Vδ1和Vδ2T细胞的特征性转录因子,对核内三种特异性T细胞转录因子Gata3、Foxp3以及T-bet进行了染色,结果表明两种细胞均表达T-bet,尤其是Vδ2T细胞表达高水平的T-bet。但两种细胞均不表达Gata3和Foxp3。在比较Vδ1T细胞和Vδ2T细胞杀伤肿瘤细胞的作用时,发现两种细胞在杀伤MGC803、 K562和G401肿瘤细胞时,Vδ1T细胞的作用均显著弱于Vδ2T细胞。综上所述,IL-4主要通过两种方式对γδT细胞的免疫应答发挥负向调节作用：第一、抑制γδT细胞活化；第二、促使γδT细胞向Vδ1T细胞偏倚,后者通过分泌大量IL-10间接抑制具有强细胞毒活性的Vδ2T细胞的增殖。此外,IL-4还抑制Vδ1T细胞表达杀伤性受体NKG2D。因此,Vδ1T细胞偏倚将导致γδT细胞介导的免疫功能减弱。本研究揭示了IL-4调节γδT细胞免疫应答的作用机制,不仅有利于对γδT细胞生物学作用的全面理解,而且有助于指导基于γδT细胞的生物学治疗。