一、目的:自然杀伤(NK)细胞来源于骨髓，主要存在于血液和淋巴样组织，约占外周血淋巴细胞的5％-10％，通过NK细胞表达的特殊标记很容易与其它型淋巴细胞区分。NK细胞属于淋巴细胞谱系细胞群，是天然免疫反应的重要效应因子。NK细胞无需抗原刺激，就能杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞。NK细胞介导的细胞毒作用依赖于多个表面受体/配体的相互作用。 NK细胞表面存在许多受体。特别是有两类显著不同的受体，通过结合MHCⅠ类分子或未知配体，来负责调节NK细胞的活性，它们是免疫球蛋白样NK细胞受体(自然杀伤抑制性受体(KillerInhibitoryReceptors，KIR)、自然杀伤细胞毒受体(NaturalCytotoxicityReceptors，NCRs)、白细胞免疫球蛋白样受体(leukocyteimmunoglobulinlikereceptor，LILR)、p75/AIRM1等)和C型凝集素样NK细胞受体(CD94/NKG2，NKG2D，NKp80，NKRP1，等)。这些受体显著的特征是通过抑制或者激活而精确调节NK细胞的功能。 抑制性受体信号是通过胞质内的免疫受体酪氨酸抑制基序(ImmunoreceptorTyrosine-basedInhibitoryMotifs，ITIM)介导的。基于受体/配体间相互作用，ITIM募集特异性磷酸酶(SHP-1，-2)，酪氨酸被磷酸化，这将导致胞内激活级联反应的抑制。许多抑制性受体(KIR，CD94/NKG2，Ly49和LILR)可识别MHCⅠ类分子，这些受体以同源分布型被所有NK细胞所表达；它们与HLAⅠ类等位基因不同类别分子的相互作用使得正常细胞免于NK细胞溶解，这是由于此作用导致了自然细胞毒作用的抑制。NK淋巴细胞只杀伤那些转化为肿瘤或病毒感染细胞，已知它们部分地或全部地丧失了MHCⅠ分子表达能力。这些观点基于经过小鼠和人类实验数据证实的“missingself”假设。NK细胞不能溶解表达自身MHCⅠ分子的正常组织，而NK细胞的触发通过非MHC限制性激活性受体介导来实现。 激活性受体通过藕联在胞内区包含免疫受体酪氨酸活化基序(ImmunoreceptorTyrosineActivatingMotifs，ITAM)的分子，如CD3ζ，FcεRIγ和DAP-12，来转导信号。而ITAM是通过磷酸化之后p72syk和ZAP70胞质PTK来实现转导活性信号的。NK细胞表达三种不同的能直接参与自然细胞毒作用的激活性受体，称为自然细胞毒受体(NCRs)，它们是NKp46，NKp44和NKp30。 NCRs属于免疫球蛋白超家族(Ig-SF)，显示有一个或两个Ig-样胞外区，在穿膜区通过含有ITAM分子转导激活信号。特别说明的是，每个NCRs的交联都会导致三个结果：p56lck与p59fyn的激活、NCRs关联多肽的酪氨酸磷酸化以及p72syk和ZAP70胞质PTK的活化。“交互作用”功能的存在也得到近期发现的支持，单个NCR的接合能够激活信号转导途径，其它NCR再由此导致NCR介导激活信号的放大。这些NK细胞所特有的表面受体，协同或增效参与NK细胞激活作用溶解靶细胞。 NKp30基因位于人类染色体6q21.32，编码一个30kD的糖蛋白，胞外区有1个IgV样结构域，在穿膜区与CD3ζ分子藕联。NKp30在人类静息及激活的NK细胞细胞表面均表达。NKp44基因位于人类染色体6q21.1，编码蛋白胞外区带有1个IgV样结构域，而在穿膜区含有一个赖氨酸，可能参与藕联KARPAP/DAP12分子。NKp44在静息的NK细胞上不表达，但能选择性的表达在经IL-2诱导的NK细胞上。 NKp46是由Sivori等于1997年利用一种能激活NK细胞溶解作用的单克隆抗体识别出一种46kD的细胞表面分子，并命名为p46。这种分子缺乏N端连接糖，只表达在静息和激活NK细胞上，而不表达在T细胞或B细胞上。除了细胞溶解作用外，这一单克隆抗体介导的关联反应还诱导胞内钙离子的增加和生成细胞因子。通过筛查人NK细胞cDNA文库，Pessino克隆出NKp46或叫LY94的cDNA，属于免疫球蛋白超家族，能与其他激活性受体(如LY95等)协同作用。 NKp46是参与NK细胞细胞毒作用最主要受体之一。NKp46的特征是胞外区有两个Ig样C2型结构域，在穿膜区与酪氨酸磷酸化的CD3ζ和FcεRIγ交联。NKp46的这两个IgC2结构域的全部结构排列类似于白细胞免疫球蛋白受体-1(LIR-1，LIR-2或LILRB1)和KIR2D免疫受体。即使NKp46、LIR-1和KIR2D在结构排列上相似，但是在LIR-1和KIR2D中负责HLA结合的氨基酸并不保存在NKp46中。例如，KIR2DL2结合HLA-Cw3的区域位于D1D2中间铰链区，而NKp46相应区域并不存在这些氨基酸。这就提示推定的NKp46配体结合位点可能位于显著不同于中间铰链区的某个分子区。而且，这可能是NKp46,像其它NCR一样，不结合经典MHCI类分子实验证据的更进一步的解释。到目前为止，鉴定的NKp46配体只有流感病毒血凝素和副流感病毒血凝素-神经氨基酶。但有关NKp46的特异性细胞配体尚未可知；要进一步研究发现人NKp46的相关配体，需要认识NKp46细胞受体的结构及其识别特异性，从分子水平了解NK细胞生物学功能。该研究采用基因工程的方法构建了人NKp46表达载体，并获得纯化的重组蛋白，为寻找人NKp46相应细胞配体做前期工作。 二、方法和结果 1.人NKp46基因克隆及序列分析 根据GeneBank报道人NKp46基因序列，设计扩增成熟人NKp46基因的上、下游引物，分别在5'端加上限制性酶切位点Ncol和EcoRI。设计上游引物时，在成熟人NKp46编码序列上游加上起始密码子ATG，同时上游加上保护性碱基TA，下游加上CG，降低G+C含量，防止二级结构的形成，提高重组蛋白质的表达含量。 取正常人新鲜外周血，提取单个核细胞，用本室配制RNA纯化试剂盒分离纯化细胞总RNA。以RNA为模板，随机六聚体核苷酸为引物，在M-MLV逆转录酶作用下进行反应，合成cDNA第一条链。 取逆转录产物为模板，以P1P2为引物，用TaqDNA聚合酶，进行PCR，扩增人NKp46基因。用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化PCR扩增产物后，与pMD18-T载体连接，转化入大肠杆菌DH5α，接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养平板上。用菌落PCR和限制性酶谱分析筛选出阳性克隆。采用ABI3100-AvantGeneticAnalyzer基因分析仪进行测序，结果显示，克隆的基因和预期的成熟人NKp46基因完全一致，成功构建了NKp46重组质粒pMD18-T-hNKp46。 2.人NKp46基因在大肠杆菌中的表达及重组蛋白的鉴定 用EcoRⅠ和NcoⅠ分别双酶切重组载体pMD18-T-hNKp46和空载体pET30a(+)，再用1％琼脂糖凝胶电泳分离纯化，获得目的基因片段hNKp46DNA及质粒载体。利用T4DNA连接酶将基因片段hNKp46DNA与酶切处理载体pET30a(+)连接，使其插入到T7lac启动子的下游，构建表达重组子pET30a(+)-hNKp46。 将连接产物转化入非表达载体大肠杆菌感受态细胞DH5a，然后接种于含有卡那霉素的LB培养平板上37℃过夜培养。利用菌落PCR，初步筛选阳性重组子。挑选阳性克隆，接种于含有卡那霉素的LB培养液37℃摇床过夜培养。采用树脂法小量提取质粒，然后用HindⅢ和BglⅡ双酶切鉴定，确定定向插入的阳性克隆。 准备表达宿主菌株BL21(DE3)感受态细胞，然后用经无菌水稀释表达重组质粒1μl(约1ng)，转化入BL21(DE3)，接种于含有卡那霉素LB培养平板上，37℃过夜培养。从新鲜培养平板中挑取单克隆菌落，将含有pET30a(+)-hNKp46的BL21(DE3)表达宿主菌株(工程菌株)接种于含卡那霉素的50mlLB培养液中，于37℃摇床培养约3小时，至对数增长期。加入诱导剂IPTG，继续诱导培养3-4小时，4℃4,000rpm5分钟离心收集菌体。 采用SDS-PAGE电泳和WesternBlotting分析重组蛋白质，用Bio-rad垂直电泳系统进行。AlphaInnotechAlphamagerTM2200凝胶图像扫描系统分析，凝胶干燥仪干燥后保存。结果显示，重组蛋白的表观分子量为38.5kD，和文献报道一致。重组蛋白约占菌体总蛋白的40％。 为研究重组hNKp46的生物学活性，进行小规模的发酵。工程菌以1：100接种于含Kan的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600约0.5，加入IPTG，继续培养4h。4℃离心收集菌体，超声破碎，离心分离上清和包涵体，进行SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白存在于包涵体中。在变性剂盐酸胍存在的条件下，利用His·Bind纯化试剂盒纯化重组蛋白，透析去除盐酸胍，PEG8000浓缩目的蛋白，并行SDS-PAGE电泳分析。 三、结论 1.成功克隆了人NKp46基因，序列分析显示，克隆的基因序列和文献报道一致。 2.构建了成熟人NKp46的原核表达载体，获得稳定表达的工程菌株，重组蛋白约占菌体总蛋白的40％。 3.初步摸索优化了重组hNKp46的表达条件。 4.获得纯化后的重组蛋白hNKp46。