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日趋严重的病原菌耐药性问题使得新型抗生素替代品的研发迫在眉睫。由于抗菌肽具有抗菌机制独特，不易产生耐药等特点已成为新药研发的热点。本研究以课题组前期从家蝇幼虫体内筛选出来的抗菌肽MDAP-2为母肽，截取MDAP-2序列中多含脯氨酸和精氨酸的片段与抗菌肽Oncocin进行杂合，获得杂合抗菌肽OM19，并对杂合肽OM19进行精氨酸(R)替换设计出改良肽OM19R。在体外抑菌活性测定中发现，抗菌肽OM19R对革兰氏阴性菌中的大肠埃希菌、沙门氏菌和志贺氏菌有很强的抑菌作用，其中对大肠杆菌的活性最强，MIC值为1μg/mL，与母肽MDAP-2相比MIC值提高了8～200倍，然而对革兰氏阳性菌无抑菌活性。以OM19R为研究对象，采用平板泳动试验、DNA凝胶阻滞试验、体外转录翻译抑制试验、扫描电镜、激光共聚焦观察以及转录组和蛋白质组等手段研究OM19R对细菌细胞膜、DNA和蛋白质之间的相互作用来探索其抑菌机理。同时对抗菌肽OM19R进行了昆虫杆状病毒表达，制备了抗菌肽OM19R，为后期临床前研究奠定基础。主要研究结果如下：
1．杂合抗菌肽的设计与活性检测
通过片段间杂合，设计出3条杂合抗菌肽，然后通过精氨酸替换(R)设计出5条改良杂合抗菌肽。体外抑菌活性测定结果表明获得了对大肠埃希菌、沙门氏菌和志贺氏菌有较高抗菌活性的杂合肽OM19R，其MIC为1~4μg/mL，而对其它革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌等无抑菌活性。溶血活性和细胞毒性实验结果表明在杂合肽OM19R的浓度在500μg/mL的情况下，杂合肽OM19R对兔红细胞不产生溶血作用，并且对小鼠巨噬细胞RAW264.7、人肾上皮细胞293，猪小肠上皮细胞IPEC-J2和中国仓鼠卵巢细胞CHO没有毒性。
2．OM19R的抑菌机制研究
通过平板泳动实验、内膜通透性实验、扫描电镜和激光共聚焦试验证实杂合肽OM19R对大肠杆菌ATCC25922的细胞膜没有破坏作用。凝胶阻滞试验证明杂合肽OM19R对细菌基因组有一定的作用，体外翻译试验发现，OM19R影响细菌总蛋白的合成，进而运用核糖体体外竞争抑制试验表明核糖体可能是抗菌肽OM19R的作用靶点，并且用体外蛋白质GFP合成试验发现OM19R的加入抑制蛋白质GFP的合成，运用体外转录翻译抑制试验证明OM19R对转录翻译有一定的抑制作用。另外，转运蛋白SbmA基因敲除试验结果表明，OM19R进入细菌菌体内的主要转运蛋白为SbmA。
3．OM19R对大肠杆菌基因及蛋白表达水平的影响
使用RNA-Seq测序技术对OM19R(1×MIC)作用大肠杆菌ATCC25922前后转录组进行了分析。总共鉴定到了13605个基因，显著差异基因2158个，其中有1662个显著上调差异基因，有496个显著下调基因。对差异基因GO和KEGG分析除了基础代谢过程外，我们还发现差异基因主要影响大肠杆菌菌体细胞蛋白质及细胞器(核糖体)合成相关基因的转录。另外，发现OM19R能够激活大肠杆菌的DNA修复系统，上调了RuvA和RuvB基因，下调了RecG基因。OM19R主要上调106个蛋白，下调156个蛋白，上调蛋白主要是ABC转运系统蛋白，下调蛋白主要是NAD(P)H脱氢酶、核酸脱胶酶，与核酸转录RNA生物合成有关的蛋白。
4．OM19R的昆虫杆状病毒表达
为了获得高活性的重组杂合抗菌肽OM19R,本研究选用了昆虫杆状病毒表达系统对OM19R基因进行串联表达。根据昆虫偏爱密码子，设计了OM19R的四倍串联体基因，并用同尾酶的方法构建了不同串联体基因，并将这些基因片段分别连接到穿梭载体pFastBacHTA和pQB3载体中，成功构建pFastBacHTA-nOM19R(n=8，12，16，20，24)和pQB3-nOM19R(n=8，12，16，20，24)，最终获得Bacmid-nOM19R(n=16，20)和qBac-ⅢG-16OM19R杆状病毒。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定，成功获得16OM19R融合蛋白。经羟胺裂解高效液相色谱法纯化获得单体OM19R，抑菌试验结果表明，纯化后的OM19R与化学合成的OM19R抗菌活性相当。
1．杂合抗菌肽的设计与活性检测
通过片段间杂合，设计出3条杂合抗菌肽，然后通过精氨酸替换(R)设计出5条改良杂合抗菌肽。体外抑菌活性测定结果表明获得了对大肠埃希菌、沙门氏菌和志贺氏菌有较高抗菌活性的杂合肽OM19R，其MIC为1~4μg/mL，而对其它革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌等无抑菌活性。溶血活性和细胞毒性实验结果表明在杂合肽OM19R的浓度在500μg/mL的情况下，杂合肽OM19R对兔红细胞不产生溶血作用，并且对小鼠巨噬细胞RAW264.7、人肾上皮细胞293，猪小肠上皮细胞IPEC-J2和中国仓鼠卵巢细胞CHO没有毒性。
2．OM19R的抑菌机制研究
通过平板泳动实验、内膜通透性实验、扫描电镜和激光共聚焦试验证实杂合肽OM19R对大肠杆菌ATCC25922的细胞膜没有破坏作用。凝胶阻滞试验证明杂合肽OM19R对细菌基因组有一定的作用，体外翻译试验发现，OM19R影响细菌总蛋白的合成，进而运用核糖体体外竞争抑制试验表明核糖体可能是抗菌肽OM19R的作用靶点，并且用体外蛋白质GFP合成试验发现OM19R的加入抑制蛋白质GFP的合成，运用体外转录翻译抑制试验证明OM19R对转录翻译有一定的抑制作用。另外，转运蛋白SbmA基因敲除试验结果表明，OM19R进入细菌菌体内的主要转运蛋白为SbmA。
3．OM19R对大肠杆菌基因及蛋白表达水平的影响
使用RNA-Seq测序技术对OM19R(1×MIC)作用大肠杆菌ATCC25922前后转录组进行了分析。总共鉴定到了13605个基因，显著差异基因2158个，其中有1662个显著上调差异基因，有496个显著下调基因。对差异基因GO和KEGG分析除了基础代谢过程外，我们还发现差异基因主要影响大肠杆菌菌体细胞蛋白质及细胞器(核糖体)合成相关基因的转录。另外，发现OM19R能够激活大肠杆菌的DNA修复系统，上调了RuvA和RuvB基因，下调了RecG基因。OM19R主要上调106个蛋白，下调156个蛋白，上调蛋白主要是ABC转运系统蛋白，下调蛋白主要是NAD(P)H脱氢酶、核酸脱胶酶，与核酸转录RNA生物合成有关的蛋白。
4．OM19R的昆虫杆状病毒表达
为了获得高活性的重组杂合抗菌肽OM19R,本研究选用了昆虫杆状病毒表达系统对OM19R基因进行串联表达。根据昆虫偏爱密码子，设计了OM19R的四倍串联体基因，并用同尾酶的方法构建了不同串联体基因，并将这些基因片段分别连接到穿梭载体pFastBacHTA和pQB3载体中，成功构建pFastBacHTA-nOM19R(n=8，12，16，20，24)和pQB3-nOM19R(n=8，12，16，20，24)，最终获得Bacmid-nOM19R(n=16，20)和qBac-ⅢG-16OM19R杆状病毒。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定，成功获得16OM19R融合蛋白。经羟胺裂解高效液相色谱法纯化获得单体OM19R，抑菌试验结果表明，纯化后的OM19R与化学合成的OM19R抗菌活性相当。