目的：　　 血管通透性的增高是糖尿病视网膜病变的一个标志性事件，是其发生的最初表现和导致其他后续改变的病理基础。内皮细胞结构和功能受损是糖尿病视网膜病变的始动环节。在糖尿病微血管病的发生过程中，高血糖所引起的蛋白质非酶糖基化形成的晚期糖基化终产物(advanced glycation end product，AGE)的作用已引起广泛的重视。本研究通过制备视网膜血管通透性增高的小鼠，利用激光共聚焦显微镜成像技术、免疫组化、蛋白磷酸化检测、RT-PCR、激酶特异性抑制剂和通透性测定的方法，在整体水平研究在AGE引起的视网膜血管通透性增高中，血管内皮细胞moesin蛋白及其磷酸化在其中的作用，探讨AGE引起moesin改变的上游信号转导通路。对moesin蛋白在AGE介导的视网膜微循环内皮细胞功能变化中作用的阐明，将有助于探讨AGE相关疾病，特别是糖尿病性视网膜病以及糖尿病性微血管病的发病机制，为临床防治提供理论依据。　　 方法：　　 1.AGE-MSA的体外制备将小鼠血清白蛋白(MSA)、葡萄糖(D-Glucose)溶解在PBS(pH7.2，0.4 mol/L)中，再加入青霉素和庆大霉素等。终浓度：葡萄糖0.2 mol/L、MSA3.5 mg/mL、青霉素90.3 U/mL、庆大霉素0.07 mg/mL、PMSF50μmol/L、EDTA0.001 mol/L、Sodium Azide0.001 mol/L。混合物用0.2μm滤器过滤：放置在37℃，8周。以相同条件但不含葡萄糖的缓冲液孵育的鼠血清白蛋白作为对照。8周后将混合液用Millipore15 mL超滤柱浓缩，Pierce Endotoxin Removing Gel去内毒素，Millipore0.22μm滤器除菌。用荧光分光光度法测定AGE含量。AGE-MSA中含有AGE72.50 U/mg protein，而对照的天然小鼠血清白蛋白中只含有AGE0.85 U/mgprotein。　　 2.对照组小鼠和AGE-MSA刺激组小鼠的处理符合国家实验动物标准的SPF级雌性C57BL/6小鼠60只，10～12周龄，16～20g。每天定时腹腔注射天然小鼠血清白蛋白或AGE-MSA10 mg/kg，连续注射7天。　　 3.p38抑制剂组和ROCK抑制剂组的处理SPF级雌性C57BL/6小鼠60只，10～12周龄，16～20g，在腹腔注射AGE-MSA(10 mg/kg)前半小时预先注射SB203580(ip，1 mg/kg)或Y27632(ip，5mg/kg)，连续7天。　　 4.视网膜血管通透性测定小鼠麻醉后固定，从小鼠尾静脉注射伊文思蓝45 mg/kg，循环1小时，在1分钟、15分钟、30分钟、45分钟和1小时取血，每次20μL，测定血浆中伊文思蓝浓度，获得时间平均伊文思蓝浓度。伊文思蓝循环1小时结束后，打开胸腔在右心房开口，在左心室灌注枸橼酸钾(37℃)，冲洗视网膜血管中的血液。灌注2分钟后取出眼球，分离视网膜，在真空离心机干燥视网膜后称取干重。将视网膜放入甲酰胺中，70℃18小时，萃取视网膜中的伊文思蓝。7000 rpm离心取上清，测定在632 nm吸收光下伊文思蓝的浓度。血视网膜屏障的破坏可以通过以下公式计算结果，单位表示为μL plasma×g retinal dry、wt-1·h-1。　　 伊文思蓝(μg/视网膜干重(g)/时间平均伊文思蓝浓度(μg/μL)×循环时间(h)5.小鼠视网膜血管内皮细胞F-actin的观测小鼠麻醉后固定在手术台，分离颈总动脉和颈静脉，从颈总动脉近心端向远心端插管，通过颈总动脉向眼球依次灌注Krebs液、3％多聚甲醛、0.1 mol/LPBS、Triton-X-100、0.1 mol/L PBS、罗丹明鬼笔环肽和0.1 mol/L PBS。灌流后，取出眼球放入4％多聚甲醛固定。约12小时后，取固定好的眼球分离视网膜，将视网膜平铺在petri小皿中央，盖上盖玻片，用树脂封片。用激光共聚焦显微镜扫描观察视网膜血管内皮细胞骨架F-actin的变化。　　 6.Western Blot检测视网膜内皮细胞moesin蛋白及其磷酸化水平将小鼠麻醉后作眼球摘除，将眼球沿角膜缘剪开，去除玻璃体，分离视网膜(不含色素上皮层)，将视网膜放入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液中，组织匀浆机冰上匀浆10 min，然后冰上静置裂解30 min，离心取上清，采用Bradford法测定蛋白浓度。蛋白变性后采用Tris/甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法获得印迹膜，将用二抗结合后的印迹膜放入TBST中漂洗3×5 min后，滤纸小心吸干膜上液体，在膜上加适量配制好的ECL发光底物(Amersham，美国)，使其于印迹膜充分作用接触，吸去多余液体，于柯达2000工作站曝光显影保存。　　 7.免疫组化分析视网膜血管内皮细胞moesin蛋白磷酸化将小鼠眼球取下经固定后石蜡包埋、切片、脱蜡水化、抗原修复后采用两步法检测视网膜血管内皮细胞moesin蛋白及其磷酸化的水平，在200和800倍光镜下观察。　　 8.RT-PCR检测视网膜血管内皮细胞moesin蛋白mRNA水平按照6的方法取眼球分离视网膜，放入Trizol中，冰上匀浆约1-2 min后室温放置5min，使其充分裂解。提取组织总mRNA后测定RNA浓度后-80℃保存。以提取的总RNA为模板，加入小鼠moesin蛋白和β-actin蛋白基因cDNA的上下游引物，进行RT-PCR，将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，用0.5μg/mL的溴化乙锭溶液染色。在紫外灯观察下，采用凝胶成像分析系统成像分析。　　 结果　　 1.AGE-MSA对小鼠视网膜血管通透性的影响及机制1.1.AGE-MSA对视网膜血管通透性的影响对照组伊文思蓝的渗出量是1.938±0.353，AGE-MSA组伊文思蓝的渗出量是5.438±0.801，AGE-MSA组视网膜伊文思蓝的渗出量较对照组显著增多(P=0.000)。结果提示AGE刺激后引起了视网膜血管内皮细胞屏障功能的破坏和通透性的升高。　　 1.2.AGE-MSA对视网膜血管内皮细胞F-actin的影响对照组视网膜血管内皮细胞骨架蛋白F-actin分布在细胞周边，线条完整连续，界限清晰；AGE-MSA刺激组F-actin线条不完整连续，出现缺损。结果提示AGE-MSA的刺激引起了视网膜血管内皮细胞骨架蛋白F-actin排列的异常。　　 1.3.AGE-MSA刺激后视网膜血管内皮细胞Moesin蛋白及其磷酸化水平的变化Western Blot结果显示AGE-MSA组的小鼠视网膜血管内皮细胞moesin蛋白的磷酸化水平较对照组显著增高(P=0.001)，但moesin蛋白的水平无显著增高(P=0.805)。提示AGE刺激引起了moesin磷酸化水平明显增高。　　 免疫组化结果显示：AGE-MSA组视网膜微血管内皮细胞的phos-moesin染色程度(与moesin比较)较对照组强，提示其磷酸化水平增加。　　 1.4.RT-PCR检测晚期糖基化终产物刺激后moesin蛋白mRNA表达水平RT-PCR检测到AGE-MSA组较对照组moesin蛋白的mRNA水平无显著差别(P=0.073)。　　 2.AGE-MSA诱导的视网膜血管内皮细胞moesin蛋白磷酸化的上游信号通路研究2.1.抑制p38 MAPK通路对AGE-MSA介导的moesin磷酸化的影响结果显示，与对照组相比，AGE刺激的小鼠视网膜微血管细胞p38 MAPK的磷酸化水平显著提高(P<0.05)；SB203580预处理组的phos-p38水平较单纯AGE刺激组显著降低(P=0.000)，提示AGE刺激引起了p38 MAPK的磷酸化激活。　　 在证明了AGE刺激导致了视网膜微血管内皮细胞moesin磷酸化的基础上，结果进一步显示，SB203580预处理组的视网膜微血管内皮细胞moesin的磷酸化水平显著低于单纯AGN激组(P=0.002)，提示p38 MAPK的磷酸化激活参与介导了moesin的磷酸化。　　 2.2.抑制ROCK通路对AGE-MSA介导的moesin磷酸化的影响结果显示，与对照组相比，AGE-MSA刺激的小鼠视网膜微血管细胞ROCK的磷酸化水平明显提高(P=0.000)；Y27632预处理组的phos-ROCK水平较单纯AGE组明显降低，提示AGE刺激引起了ROCK的磷酸化激活。　　 在证明了AGE-MSA刺激导致了视网膜微血管内皮细胞moesin磷酸化的基础上，结果进一步显示，Y27632预处理组的视网膜微血管内皮细胞moesin的磷酸化水平明显低于单纯AGE刺激组(P=0.005)，提示ROCK磷酸化激活参与介导了moesin的磷酸化。　　 2.3.抑制p38 MAPK和ROCK磷酸化活性对视网膜血管内皮细胞moesin蛋白mRNA水平的影响对照组、AGE-MSA刺激组、p38 MAPK阻断剂组和ROCK阻断剂组moesin蛋白mRNA水平无显著差别(P=0.127)。结果提示，抑制p38 MAPK和ROCK的磷酸化激活不影响moesin蛋白的表达。　　 2.4.抑制p38和ROCK的磷酸化激活对小鼠视网膜血管内皮细胞F-actin形态变化的影响AGE-MSA组F-atlcin线条不完整连续。给予p38抑制剂SB203580或ROCK抑制剂Y27632可抑制AGE刺激后的内皮细胞形态学改变，可见比较完整的细胞骨架，线条比较完整清晰，与对照组形态基本一致。结果提示抑制p38 MAPK和ROCK信号转导通路，可以防止小鼠视网膜微血管内皮细胞骨架F-actin的重新分布。　　 2.5.抑制p38和ROCK的磷酸化激活对小鼠视网膜血管内皮细胞屏障功能的影响p38 MAPK阻断剂组伊文思蓝的渗出值是2.576±0.388，与AGE-MSA刺激组伊文思蓝的渗出值5.438±0.801相比有显著性差异(P=0.000)，p38MAPK阻断剂预处理显著减少了小鼠视网膜血管伊文思蓝的渗出，降低了视网膜血管的通透性；ROCK阻断剂组伊文思蓝的渗出值是2.565±0.528，与AGE-MSA组相比有显著性差异(P=0.000)，ROCK阻断剂预处理显著减少了小鼠视网膜血管伊文思蓝的渗出，降低了视网膜血管的通透性。　　 结论：　　 1.掌握了制备AGE引起视网膜血管通透性增加的小鼠的方法，开展了整体灌注的F-actin染色法，为今后的有关研究打下了方法学的基础。　　 2.AGE可以引起视网膜血管内皮细胞骨架F-actin的重新分布，导致视网膜血管通透性增加，血管视网膜屏障破坏，提示糖尿病视网膜病变中AGE可能起着重要作用。　　 3.AGE刺激导致了视网膜血管内皮细胞moesin蛋白磷酸化水平的明显升高。　　 4.p38MAPK和ROCK信号转导通路参与了AGE介导的moesin蛋白的磷酸化。　　 5.通过抑制p38 MAPK和ROCK信号转导通路，可以防止小鼠视网膜微血管内皮细胞骨架F-actin的重新分布，降低视网膜血管通透性的增加。　　 6.结果提示，AGE通过激活p35 MAPK和ROCK通路，引起moesin的磷酸化，并进一步导致视网膜血管屏障功能的降低。