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目的:IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)是常见的原发性肾小球肾炎疾病,但目前缺乏有效治疗方法。异常糖基化IgA1(Gd-IgA1)及其免疫复合物在肾小球的沉积是IgAN发病机制的关键环节,以清除低糖基化IgA1及其免疫复合物为治疗靶点的药物成为IgAN治疗的潜在手段。我们的前期研究显示,病原菌来源的IgA酶可以通过特异性切割IgA1,在体内外降解异常糖基化IgA1及其免疫复合物,然而因其缺乏靶向性及存在的免疫原性和潜在毒副作用降低了临床应用价值。因此,本研究根据前期研究结果,选择酶活性更佳的流感嗜血杆菌(ATCC 49247)来源的基因工程IgA酶进行纳米粒工艺包装,研究纳米粒包装能否提高IgA酶递送至肾小球系膜区的靶向性和对IgA1免疫复合物的降解作用以及纳米粒包装后的IgA酶能否具备更低的生理毒副作用。方法:1.高活性重组IgA酶的制备。从流感嗜血杆菌(ATCC 49247)中克隆IgA酶基因全长,构建His6-IgA酶原核融合表达载体,在大肠杆菌E.coli(BL21)中进行原核表达,采用镍柱亲和层析法和离子交换色谱法大量制备高纯度的具有生物活性的IgA酶,纯化后的IgA酶经SDS-PAGE电泳后银染法和Elisa法检测酶对IgA1的分解活性,BCA法测定蛋白浓度;2.纳米粒的制备及其对肾脏靶向性的确定。利用纳米粒包装工艺制备直径为60-120 nm的纳米粒,制备带正电荷,能对呈明显负电荷的肾小球系膜区和基底膜有静电亲和力的纳米粒(nanoparticles),同时将制备的带负电荷不亲和肾小球系膜区的纳米粒(ddab nanoparticles)设为对照,制备过程中对白蛋白(纳米粒制备原料)进行罗丹明(rhodamine-DHPE)荧光物质标记。将雄性BALB/c小鼠每组3只随机分配,分别设为PBS组(negative control),带正电荷的纳米组(nanoparticles)和带负电荷的纳米粒组(ddab nanoparticles),分别将PBS或两种纳米粒经尾静脉注射至BALB/c小鼠体内,不同时间点(5min/15min/30min)处死老鼠,取心、肝、脾、肺、肾组织,冰冻切片观察肾脏和其他组织的荧光分布,确定肾脏靶向性最优直径的纳米粒。3.IgA酶纳米粒的制备及其在小鼠体内肾系膜靶向性的确定。在确定最优靶向直径的纳米粒后,制备IgA酶纳米粒,并通过SDS-PAGE电泳后银染法检测IgA酶纳米粒的生物活性。将正常雄性BALB/c小鼠随机分为IgA酶纳米粒组(nanoparticles)、纳米粒组(blank nanoparticles)和PBS对照组(negative control),每组3只。每组分别向小鼠尾静脉中注射肾脏靶向最优直径(~120 nm)的荧光标记的IgA酶纳米粒、纳米粒或PBS,5min后处死小鼠,检测IgA酶纳米粒在小鼠体内各器官(心、肝、脾、肺、肾组织)的分布,观察IgA酶纳米粒在肾小球系膜区和其他组织的定位,并通过小动物活体成像技术观察纳米粒的肾脏靶向性。通过该部分的研究确定IgA酶纳米粒能够靶向性到达肾脏。4.IgA酶纳米粒对passive IgAN模型小鼠体内沉积IgA1免疫复合物降解作用的研究。通过尾静脉注射人源低糖基化处理的IgA1-IgG免疫复合物到BALB/c小鼠体内,构建以系膜免疫复合物沉积为特征的小鼠passive IgAN模型。将雄性BALB/c小鼠随机分为4组,每组3只,分别为PBS对照组(PBS),模型组(IgA1-IgAG),IgA酶治疗组(IgA protease)和IgA酶纳米粒治疗组(IgA protease-NPs)。在注射免疫复合物12 h后,治疗组给予尾静脉注射靶向性最优直径(~120 nm)的IgA酶纳米粒或常规IgA酶,2 h后分别处死小鼠,取新鲜肾脏组织做冰冻切片,免疫荧光比较观察IgA1-IgG免疫复合物清除情况。5.IgA酶纳米粒生理毒性的分析。将雄性BALB/c小鼠随机分为4组,每组3只,分别为PBS对照组(negative control),模型组(model),IgA酶治疗组(IgA protease)和IgA酶纳米粒治疗组(nanoparticles)。在造模12 h后,治疗组给予尾静脉注射靶向性最优直径的IgA酶纳米粒或常规IgA酶,于2 h、7 days和30 days后分别处死小鼠,采血做生化检测,并测定肝、肾功能(ALT、AST和CREA、BUN),另外取心、肝、脾、肺和肾组织进行苏木素-伊红染色(HE染色),观察各组织的形态结构。结果:1.银染结果提示IgA酶的成功纯化,经纳米粒包装后的IgA酶有良好的生物活性,并且与常规IgA酶的生物活性无差异;2.原位组织荧光结果显示直径约为120 nm的纳米粒和IgA酶纳米粒都能靶向性到达肾脏系膜区,小动物活体成像结果表明尾静脉注射荧光标记的纳米粒至小鼠体内5 min后,纳米粒较对照组表现出明显的肾脏积聚性,差异具有统计学意义(P<0.05);3.免疫荧光结果显示在肾脏系膜区有大量免疫复合物沉积,验证小鼠passive IgAN模型的成功构建。与模型组相比,IgA酶纳米粒和常规IgA酶治疗组小鼠肾脏系膜区的免疫复合物显著减少;同时与常规IgA酶治疗组相比,IgA酶纳米粒组小鼠肾脏系膜区的免疫复合物明显更少,甚至有些复合物已被完全清除。4.HE染色结果显示IgA酶纳米粒组和IgA酶组小鼠的心、肝、脾、肺、肾各组织结构皆无病理改变,与正常PBS对照组相比无差异;生化检测结果亦提示各组肝肾功能正常。结论:与常规IgA酶相比,IgA酶纳米粒有更好的肾系膜靶向性,其清除和降解肾脏系膜区免疫复合物的效果比常规IgA酶更佳且无明显毒副作用。