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研究背景及目的创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)是神经外科的常见病、多发病,具有高发病率、高致残率和高死亡率等特点,是急需解决的临床问题。兴奋性氨基酸的过度释放被认为是TBI后继发性损伤机制的起始因素,其神经毒性作用对患者的预后产生重要的影响。KCC2作为成熟神经元细胞氯离子浓度梯度的关键调节因子,在脑内GABA介导的内源性抑制性神经传递作用中发挥重要作用。然而,到目前为止,有关KCC2在TBI中的抗兴奋毒性损伤作用及其病理生理意义研究甚少。另一方面,褪黑素(melatonin, Mel)作为是一种由松果体合成与分泌的吲哚胺类神经内分泌激素,具有抗炎和抗氧化等多种神经保护作用。在TBI模型中,Mel能够减少TBI后脑组织细胞死亡,但其具体的分子作用机制尚未明确。本研究拟通过研究KCC2在TBI后皮层脑组织中动态表达及分布情况,探讨KCC2的表达水平与TBI的相互关系,以期为TBI的治疗提供一个新靶点。其次,本课题试图验证褪黑素对TBI大鼠具有脑保护作用,并探索该作用是否与脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)/KCC2信号通路的激活及神经元凋亡被抑制相关,为探索抑制TBI后神经元凋亡开拓新的研究思路。研究方法根据不同的实验内容,该研究分两部分：(1)该实验拟研究KCC2在TBI后皮层脑组织中动态表达及分布情况,探讨KCC2的表达水平与TBI的相互关系。采用定量脑皮质挫伤方法建立TBI模型后,检测大鼠损伤侧皮层脑组织中KCC2蛋白表达水平在TBI后Oh,3h,6h,12h,24h,72h及168h的表达状况。采用荧光定量PCR技术检测KCC2mRNA在TBI后168h内损伤侧皮层脑组织中表达水平随时间的变化趋势。采用免疫荧光技术观察KCC2与神经元及胶质细胞共定位的情况。(2)该实验拟探讨大鼠TBI后褪黑素治疗在神经元凋亡中的作用,并探讨该作用是否与脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)/KCC2信号通路激活及神经元凋亡被抑制相关。雄性SD大鼠随机分成以下3组：sham+vehicle组;TBI+vehicle组；TBI+褪黑素组。于TBI建模成功后5min,1h,2h,3h,4h腹腔给予褪黑素或相应等体积的vehicle(生理盐水+95%乙醇)。手术后24h取假手术组、损伤组和治疗组损伤中心区皮层组织行FJB染色(Fluoro-Jade B staining)检测神经元变性坏死水平；对损伤侧皮层BDNF、ERK、p-ERK、KCC2和活化的caspase-3表达水平进行检测；用TUNEL染色与NeuN共染评估神经元凋亡状况；采用改良的神经功能缺损评分(mNSS)评价各组大鼠手术后24h神经功能缺损状况；同时采用干/湿重称量法计算各组大鼠手术后24h脑组织含水量脑组织含水量并进行统计分析。研究结果(1)研究发现,TBI后损伤侧皮层脑组织中的KCC2蛋白量呈降低趋势,于12h开始出现显著降低(p<0.05),直至伤后168h(p<0.05)。荧光定量PCR结果显示：与0h组相比,损伤侧皮层脑组织KCC2mRNA水平在损伤后6h开始即出现显著降低(p<0.05),持续至伤后168h(p<0.05)。免疫荧光结果显示：KCC2与NeuN,而非GFAP共染；此外,KCC2表达于细胞膜而非定位于细胞核中。(2)与sham+vehicle组比较,TBI后大脑皮层BDNF、p-ERK和KCC2的表达明显降低,而激活态的caspase-3表达水平明显增加,同时神经元凋亡、脑水肿及神经功能缺损明显加重(P<0.05)；与TBI+vehicle组比较,褪黑素干预后大脑皮层BDNF、p-ERK和KCC2的表达明显升高,神经元凋亡减少,脑水肿减轻,同时神经功能得到改善(P<0.05)。研究结论TBI后损伤侧皮层脑组织中神经元特异的KCC2蛋白及mRNA表达水平持续降低,提示其可能参与了TBI后继发性损伤的病理过程。进一步研究发现,KCC2表达下调可能促进了TBI后神经元凋亡。Mel能促进脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)的表达及细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)的激活,进而上调KCC2的表达,从而缓解TBI后caspase-3激活及神经元凋亡,并减轻脑水肿及改善TBI后的神经功能缺失。