前言急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是指由多种因素引起的严重的肝脏损伤或大量肝细胞的坏死,导致肝脏的合成、排泄、解毒及生物转化等功能发生严重障碍,并出现以凝血机制障碍、黄疸、腹水和肝性脑病等为主要表现的一组临床症候群。传统的内科治疗并不能逆转肝衰竭患者的预后,目前肝移植术是临床上唯一有效的治疗方式。但由于供体来源短缺、等待移植时间过长、手术费用昂贵以及术后需终生服用免疫抑制剂等缺陷限制了其应用。干细胞(stem cells)是一类具有自我复制更新和多向分化潜能的细胞。近些年来,干细胞移植同样也被用于治疗包括ALF在内的各种终末期肝病的实验及临床研究,并取得了一定的成果。但是要实现将干细胞应用于临床治疗中仍要面临三个问题:1、安全性--残留在体内的未分化的干细胞有成瘤风险;2、分化细胞的质量和纯度仍有欠缺;3、异体干细胞移植可能存在较为严重的免疫排斥反应。内胚层干细胞(Endoderm Stem/Progenitor Cell,EPC)作为新型的干细胞,是世界上首次建立的稳定原始胚层干细胞系,该细胞系由多能诱导干细胞分化而来,可在体外高效诱导分化为各类内胚层来源细胞类型,并且具有在体内不形成肿瘤的优点。这为干细胞移植治疗ALF提供了新的材料。本课题首次将EPCs应用于急性肝衰竭的治疗中,旨在明确EPCs对急性肝衰竭的治疗作用。第一部分:内胚层干细胞移植对急性肝衰竭的治疗作用研究目的:探讨EPCs对急性肝衰竭的治疗效果。方法:腹腔注射D-氨基半乳糖(500mg/kg)和LPS(50ug/kg)诱导大鼠急性肝衰竭。80只大鼠随机分为4组:正常组(n=20);ALF组(n=20),腹腔注射D-氨基半乳糖(500mg/kg)和LPS(50ug/kg)诱导大鼠急性肝衰竭;假手术组(n=20),造模后开腹门静脉注射1ml生理盐水;EPC治疗组(n=20),造模后开腹门静脉注射1×10^7个EPCs。每组随机抽取10只大鼠用于行为学和生存期观察,其余大鼠于注射后各时间点检测各组大鼠转氨酶、总胆红素、血氨、凝血酶原时间、肝脏HE染色、TUNEL染色检测肝细胞凋亡水平和免疫组合Ki67染色检测肝细胞增殖水平。结果:假手术组的行为学表现、生存率、肝功能、血氨、凝血酶原时间、肝脏HE染色、免疫组化Ki67染色剂TUNEL染色均与ALF组高度相似。相比于ALF组和假手术组,EPC治疗组的行为学表现更好,生存率提高40%,ALT、AST、总胆红素、血氨、凝血酶原时间下降30%-40%,同时肝脏HE染色显示肝脏坏死范围明显缩小、炎症细胞浸润程度明显减轻;免疫组化Ki67染色显示EPC治疗组肝细胞的增殖水平明显增高;TUNEL染色显示EPC治疗组肝细胞的凋亡水平更低。结论:门静脉移植EPCs可以对大鼠急性肝衰竭起到治疗作用。第二部分:内胚层干细胞治疗急性肝衰竭的机制研究目的:探讨EPCs治疗急性肝衰竭的相关机制。方法:首先,ELISA检测EPCs移植后大鼠肝脏内鼠源性IL-10和人源性IL-10的水平。然后,将EPC和肝衰竭大鼠共血清培养24h、48h后收集上清,检测上清中人源性IL-10的水平。接着60只大鼠随机分为3组:正常组(n=20);ALF组(n=20):腹腔注射D-氨基半乳糖(500mg/kg)和LPS(50ug/kg)诱导大鼠急性肝衰竭;IL-10治疗组(n=20):将鼠源性IL-10(30ug/kg)通过尾静脉注射入肝衰竭大鼠体内。检测各组大鼠生存率、肝功能、血氨、凝血酶原时间和肝脏组织学,比较治疗效果。最后,我们将80只大鼠随机分为4组:正常组(n=20);假手术组(n=20):腹腔注射D-氨基半乳糖(500mg/kg)和LPS(50ug/kg)诱导大鼠急性肝衰竭,开腹门静脉注射1ml生理盐水;EPC治疗组(n=20):造模后开腹门静脉注射1×10^7个EPCs;anti-IL-10组:造模及开腹门静脉注射1×10^7个EPCs后,尾静脉注射抗IL-10抗体(20mg/kg)。检测各组大鼠生存率、肝功能、血氨、凝血酶原时间和肝脏组织学,比较治疗效果。结果:ELISA显示ALF组和假手术组中鼠源性IL-10含量处于同一水平;EPC移植组大鼠肝脏内鼠源性IL-10水平相比ALF组和假手术组明显增高;所有分组中人源性IL-10水平都很低且无统计学差异。EPC与肝衰竭大鼠血清共培养后上清人源性IL-10的水平没有上升。尾静脉注射鼠源性IL-10能明显降低肝衰竭大鼠的死亡率,降低血液中ALT、AST、总胆红素、血氨及凝血酶原时间,肝脏HE染色显示肝脏坏死范围明显缩小。在接受EPC移植治疗的肝衰竭大鼠尾静脉注射抗IL-10抗体后,血液中ALT、AST、总胆红素、血氨及凝血酶原时间明显上升,肝脏HE染色显示肝脏坏死程度及炎症细胞浸润程度明显上升。结论:EPCs可以通过刺激肝衰竭大鼠体内产生IL-10发挥治疗作用。