随着肥胖、高脂血症、2型糖尿病和代谢综合征等疾病在全世界范围的流行,非酒精性脂肪性肝(NAFLD)的发病率也不断上升。近期研究表明,经过4~13年后大约50%的NAFLD患者发展为非酒精性脂肪肝炎(NASH),40%的发展为肝纤维化。NAFLD的病理生理过程极为复杂,其发病机制仍不明确,并且目前没有有效的治疗方法,NASH的预后也不容乐观。因此,非常有必要对非酒精性脂肪肝患者制定有效的干预措施。NAFLD患者常伴有肥胖、胰岛素抵抗,但并不是所有的肥胖者都可以发展为NAFLD,肠道因素在NAFLD的致病机制中发挥了很大作用。研究显示,肠道内的革兰氏阴性菌产生肠源性内毒素(LPS),它们经门静脉输送到肝脏,当肠道菌群失衡时,大量的革兰氏阴性菌增殖并产生内毒素,就会导致患者发生代谢紊乱,肥胖,糖尿病,NAFLD以及NASH。在对急性肝损伤小鼠模型研究发现,小鼠肠粘膜通透性增强和细菌移位,并出现肠道菌群的改变。此外,在对NAFLD患者以及动物模型的研究中同样发现,其循环内毒素水平都明显高于正常水平,还存在着小肠细菌过度生长,肠粘膜通透性增加的现象。由于肠道菌群和肥胖、胰岛素抵抗、NAFLD密切相关,所以通过调节肠道菌群结构有可能起到防治NAFLD的作用。益生菌和中药均可以通过调节肠道菌群改善NAFLD。已经有研究显示,益生菌具有调节肠道微生态平衡和降低机体胆固醇水平的作用,许多益生菌被制作成酸奶供高脂血症和NAFLD患者食用。此外,决明子作为一种具有抑制脂肪积累的天然功能性食品添加剂,在改善肥胖,胰岛素抵抗等代谢疾病中取得了良好的效果,这为NAFLD的治疗提供了新的方向。决明子是豆科一年生草本植物,广泛种植于热带亚洲国家,其主要有效成分为蒽醌类化合物,包括:决明素、大黄素、芦荟大黄素等。它的草本成分被作为一种功能性饮料在该地区流行,并且具有降血脂,降胆固醇,抗氧化,抗真菌,保护神经功能等生理效应。决明子不仅对急性肝损伤大鼠肝功能有保护作用,而且可以通过上调AMP依赖的蛋白激酶,从而改善肥胖、胰岛素抵抗以及NAFLD。虽然,益生菌和决明子均具有改善肥胖、胰岛素抵抗、NAFLD等代谢疾病的效果,但是益生菌联合决明子总蒽醌是否可以提高NAFLD的防治效果仍不明确。综上所述,我们假设益生菌联合决明子总蒽醌可以更好的改善NAFLD,其机制可能与调节肠道菌群结构以及肝脏的能量代谢有关。为了验证上述假设,我们拟通过体外筛选和鉴定具有明确降脂效果的益生菌菌株,并与决明子蒽醌进行联合培养,验证其降脂效率的变化。再将筛选出的降脂益生菌联合决明子总蒽醌对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠进行干预,并验证干预效果。第一部分降脂益生菌的体外筛选及生物学特性研究目的:前期我们使用硫酸铁铵法,从健康人体以及传统发酵食物中,筛选出了具有高效降胆固醇的菌株(体外降胆固醇效率>50%)。在此基础上,我们进一步评估其降甘油三酯的能力,以及耐酸、耐胆盐、耐胃蛋白酶、耐胰蛋白酶、细胞黏附性等生物学特性,并联合决明子总蒽醌共培养,了解其降脂效率的变化,选出最优菌株为下一步实验打下基础。材料与方法:1.降胆固醇菌株与决明子总蒽醌联合培养,在MRS胆固醇培养基中,使用硫酸铁铵法对其降胆固醇效率进行检测,并比较前后降胆固醇效率的变化。2.在MRS甘油三酯培养基中,对降胆固醇菌株以及其和决明子总蒽醌联合培养的降脂效率进行检测,并比较降甘油三酯效率的变化。3.对菌株进行耐受胃酸、耐受胆盐、耐受胃蛋白酶、耐受胰蛋白酶、细胞黏附性实验,评估其生物学特性。4.将筛选出的最优菌株进行质粒检测,并提取DNA进行菌种鉴定。结果:1.降胆固醇菌株联合决明子总蒽醌联合培养后,降胆固醇效率均有所提升,其中以DM9054、DM9073、86066前后降解效率提高最为显著(P<0.05)。2.降胆固醇菌株联合决明子总蒽醌联合培养后,菌株8503、84034、86066降甘油三酯提高最为显著(P<0.05)。3.菌株DM9054和86066具有较好的耐胃酸能力,菌株DM9007、DM9054、86066有较好的耐胆盐能力,DM9054和86066有较好的胃蛋白酶耐受能力,各个菌株对胰蛋白酶均有很好耐受力;相对于其他菌株,菌株DM9007、DM9054、86066细胞黏附性最强(P<0.05)。4.最优菌株为DM9054、86066,检测无质粒存在,经过16Sr DNA测序比对,DM9054为鼠李糖乳杆菌、86066为植物乳杆菌。结论:DM9054为鼠李糖乳杆菌、86066为植物乳杆菌,均为益生菌,并且其联合决明子总蒽醌培养可以提高降解胆固醇和甘油三酯的效率,起到协同作用。同时,菌株具有较好的耐受消化液以及对肠上皮细胞的黏附能力,并不带有质粒。第二部分降脂益生菌联合决明子总蒽醌对非酒精性脂肪肝大鼠脂代谢及相关基因表达的影响目的:通过筛选出的降脂益生菌DM9054、86066,并联合具有协同降脂作用的决明子总蒽醌,共同干预NAFLD大鼠,分析其对脂代谢过程中相关基因和蛋白表达情况,以期发现降脂益生菌联合决明子总蒽醌可能在脂代谢通路中的作用靶点,进一步探讨其改善NAFLD的机制。材料与方法:1.SD大鼠随机分为5组,分别给予正常饮食(ND),高脂饮食(HFD),高脂饮食+决明子总蒽醌0.2g/kg(HFD+AC),高脂饮食+高效降胆固醇益生菌2×1010 CFU/m L(HFD+P),高脂饮食+决明子总蒽醌+益生菌(HFD+TAC+P),所有分组大鼠连续干预150天后处死。2.评估各组大鼠一般情况,以及体重、Lee’s指数及肝指数变化。3.检测各组大鼠血脂水平、胰岛素抵抗情况,评估血清内毒素和肝脏TNF-α水平,并通过HE和油红O染色观察各组大鼠肝脏病理学改变。4.检测大鼠肝脏CYP7A1、HMGCR、LDLR m RNA表达水平,以及肠道FXR m RNA表达水平,Western-Bloting检测肝脏PPAR-α、PPAR-γ、SREBP-1c蛋白表达水平。结果:1.连续150天高脂饮食诱导,成功建立了非酒精性脂肪肝大鼠模型。2.各组大鼠生命体征平稳,高脂饮食组大鼠体重、Lee’s指数及肝指数较其余各组显著增加(P<0.05),通过降脂益生菌、决明子总蒽醌以及其联合应用,均可以显著降低大鼠体重、Lee’s指数及肝指数(P<0.05)。3.高脂饮食组大鼠TC、TG、LDL、FFA、胰岛素抵抗状态、血清内毒素以及肝脏TNF-α水平,较其余各组均显著升高(P<0.05),而HDL则显著降低(P<0.05),并且肝脏HE和油红O染色可见明显脂肪变性以及炎细胞浸润。使用降脂益生菌、决明子总蒽醌以及联合应用干预后,均显著降低了TC、TG、LDL、FFA,胰岛素抵抗状态、血清内毒素以及肝脏TNF-α水平,并升高了HDL(P<0.05),肝脏病理观察,不同程度改善了肝脏脂肪变性以及炎细胞浸润程度。4.与高脂饮食组相比,通过降脂益生菌、决明子总蒽醌以及二者联合应用的干预,显著上调了肝脏CYP7A1、LDLR m RNA,PPAR-α蛋白和肠道FXR m RNA的表达,并下调肝脏中HMGCR m RNA以及SREBP-1c、PPAR-γ蛋白的表达(P<0.05)。结论:降脂益生菌和决明子总蒽醌可以通过调节大鼠血脂水平,以及脂代谢相关基因的表达,改善高脂饮食诱导的NAFLD大鼠,而且二者联合应用效果最为显著。其具体机制可能是:通过上调肝脏中CYP7A1、LDLR m RNA,以及肠道FXR m RNA的表达,并抑制SREBP-1c的生成,促进胆固醇吸收和排泄。并下调肝脏中HMGCR m RNA的表达,减少胆固醇合成。同时促进肝脏中PPAR-α的表达,抑制PPAR-γ的表达,促进胆固醇代谢,减少其外流的作用。从而调节了大鼠血脂代谢水平,改善了胰岛素抵抗状态,并降低了肝脏炎症因子和肠源性内毒素的释放。第三部分降脂益生菌联合决明子总蒽醌对非酒精性脂肪肝大鼠肠道菌群结构及肠黏膜屏障功能的影响目的:肠道菌群结构和肠黏膜屏障功能在NAFLD发病过程中起重要作用。因此,在第二部分研究的基础上,进一步探讨降脂益生菌、决明子总蒽醌以及其联合应用,通过调节肠道菌群结构和肠黏膜屏障完整性改善NAFLD的作用机制。材料与方法:1.通过粪便DNA提取试剂盒提取各组大鼠粪便样本DNA,并对DNA质量进行检测,进一步对V4区进行扩增,琼脂糖电泳检测扩增效果。2.通过Illumina Miseq平台对大鼠肠道50、100、150天样本进行测序,并对序列进行修剪和分类,获取优质序列进行分析。3.根据测序结果,对各组大鼠肠道菌群组成、物种丰度差异以及各组肠道菌群结构的组间相似性进行分析。4.病理切片观察各组大鼠肠黏膜情况,Western-Blotting检测肠黏膜紧密连接蛋白Occludin以及ZO-1表达情况。结果:1.对各组大鼠粪便样本提取总DNA质量检测,OD260/OD280总体值均在1.8~2.0之间,并使用V4区引物,成功扩增出条带。2.通过Illumina Miseq高通量测序共得到7,583,846条序列信息,经过修剪和筛选获得5,740,971条优质序列,优质序列比例为75.7%,平均每个样本63,788条,序列长度均在225~226bp之间。并且从序列的稀释曲线可以看出足够覆盖肠道微生物中97%以上的菌种,且丰度分布均匀。3.对各组大鼠肠道菌群组成分析发现,高脂饮食组肠道厚壁菌门比例增加显著,并且拟杆菌门比例显著减少。在分析大鼠肠道微生物属水平时,我们发现与正常饮食组相比,高脂饮食大鼠肠道拟杆菌属、乳酸菌属、变性菌属丰度均显著降低,而颤螺旋菌属丰度却显著升高(P<0.05)。通过降脂益生菌和决明子总蒽醌干预,升高了拟杆菌属、乳酸菌属、变性菌属丰度,并降低了颤螺旋菌属丰度(P<0.05)。降脂益生菌联合决明子总蒽醌效果最为显著。对各组大鼠肠道微生物的组成以及相似性,进行了PCo A分析和聚类分析。结果显示通过降脂益生菌联合决明子总蒽醌干预的大鼠,肠道菌群结构最接近于正常。热图的聚类分析也进一步证实了此结果。4.病理观察发现高脂饮食组大鼠小肠绒毛出现断裂,缺失,间隙增宽,上皮细胞坏死、脱落的现象;并且肠道紧密连接蛋白Occludin以及ZO-1表达量较其它各组显著降低(P<0.05)。而通过降脂益生菌、决明子总蒽醌以及其联合应用干预后,各干预组绒毛排列较为整齐,缺失断裂减少,形态有所恢复;还增加了肠道紧密连接蛋白Occludin以及ZO-1表达量(P<0.05)。结论:降脂益生菌、决明子总蒽醌以及其联合应用,均可以通过调节肠道菌群结构,使失衡的肠道菌群更趋于正常,并促进肠道紧密连接蛋白Occludin以及ZO-1的表达,提高肠黏膜屏障完整性,从而起到改善NAFLD的作用。