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BHK-21细胞是WHO推荐的兽用疫苗生产用细胞基质,BHK-21细胞悬浮培养模式在规模化生产中取得了广泛的应用。悬浮培养技术较传统的转瓶贴壁培养工艺在疫苗产量和质量上均有明显优势,该技术已在我国口蹄疫疫苗生产中得到应用。悬浮培养技术中悬浮细胞株的驯化、个性化培养基开发和生物反应器培养工艺是培养工艺的三个关键因素,也是未来研究的主要方向。目前在疫苗生产中BHK-21细胞虽以悬浮型的模式在培养,但其细胞密度与工业化生产所需高细胞密度相差较大。悬浮型BHK-21细胞株与贴壁型细胞一样,在群体倍增过程中单细胞生长差异较大,有的细胞长得快,有的细胞长得慢,有的细胞耐久力长,有的细胞耐久力短。单细胞克隆株细胞由同一个细胞增殖而来,因此有较强的同源性、稳定的遗传性和均一的生物学性状,本试验试图通过单细胞培养法对现有悬浮细胞系进行单细胞克隆,对单细胞克隆株进行扩大培养,将生长快、耐久力长的克隆株进行冻存,对冻存的克隆细胞株根据倍增时间、最大增殖密度筛选出能高密度生长的单克隆细胞株。本研究首先对甘肃省动物细胞工程技术研究中心自主驯化的BHK-21悬浮细胞进行生物学特性鉴定。鉴定合格的BHK-21悬浮细胞,用有限稀释法按照每孔1个细胞的密度接种于96孔U型培养板、96孔平底培养板、24孔琼脂层培养板中进行单细胞克隆。单细胞经过12d的培养长满培养孔底部,扩大培养单克隆细胞获得14个单克隆细胞株,建立了相应的细胞库。复苏单细胞克隆株进行单克隆的筛选,其中4个单克隆细胞生长比其他克隆细胞株具有明显的优势。对4个单细胞克隆株的生物学特性进行鉴定,并与克隆前的BHK-21悬浮细胞各项生物学特性进行对比。结果显示,单细胞克隆株的各项生物学特性稳定、未发生变异,克隆得到稳定生长的细胞株,建立了悬浮细胞单细胞克隆的可行方法。对4株单细胞克隆株进行口蹄疫病毒146S抗原表达测定,其中CL18克隆株表达抗原最高为2.70μg/ml,确定了 CL18克隆株为最优细胞株。对CL18克隆株的生长特性进行研究,确定了以6.0×105/ml为最佳接种密度,在摇瓶中批培养细胞最大增值密度为834×104/ml;以48h和72h流加培养的方式培养细胞最大增值密度为905×104/ml。利用5LNBS生物反应器培养CL18细胞,60×104/ml的接种密度接种细胞,批培养的方式进行培养,在72h时细胞增殖密度达到最大值为741×104/ml;,以60×104/ml的接种密度接种细胞,以48h和72h进行流加的方式进行培养,在120h时细胞增殖密度达到最大值为921×104/ml。说明经筛选鉴定的单克隆BHK-21CL18株具有在FMD疫苗生产应用的良好前景。