猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是危害养猪业的重要病原之一,主要引起怀孕母猪的流产、早产和死胎等综合繁殖障碍疾病,仔猪和育肥猪出现呼吸道综合症状,对全球养猪业造成巨大经济损失。聚合体(aggresome)作为病毒蛋白聚集场所和形式,为病毒复制和装配提供丰富物质基础,同时能避免免疫系统的识别而不被降解,细胞蛋白14-3-3是参与聚集体形成的重要蛋白之一。PRRSV非结构蛋白nsp2由ORF1a编码的具有复杂结构域和功能的蛋白。前期研究的基础发现,nsp2蛋白体外过表达后能发生聚集形成聚合体。为进一步研究nsp2表达与聚集体形成的结构区域,将nsp2蛋白进行截断表达分析,寻找与聚集体形成有关的关键区域,为疫苗的设计提供理论依据。根据nsp2蛋白结构蛋白,将其分成半胱氨酸酶活性的结构域、高变区、跨膜区及羧基端尾巴4段。分别克隆入带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的真核表达载体。将构建的重组质粒转染PRRSV易感细胞Marc-145,非易感细胞BHK-21细胞,用共聚焦显微镜观察表达的nsp2蛋白形成aggresome情况,结果发现聚集体的形成与高变区及羧基端尾巴有关。前期的研究还发现,nsp2与14-3-3蛋白具有相互作用,14-3-3蛋白在聚合体形成过程中起着重要作用。用不同14-3-3不同亚型的抗体进行共定位分析发现,nsp2与alpha/beta和epsilon亚型的14-3-3蛋白具有相互作用。为进一步研究聚集体形成的机制,将截断表达的nsp2蛋白分别转染293T细胞和Marc-145细胞,经pull-down和Western blot分析发现,14-3-3与nsp2高变区具有相互作用,进一步的共聚焦显微镜观察发现alpha/beta和epsilon亚型的14-3-3蛋白与nsp2的高变区及羧基端尾巴具有共定位作用。用抗14-3-3 alpha/beta亚型的抗体进行免疫共沉淀,沉淀产物进行质谱分析,检测到了nsp2蛋白。以上结果表明,nsp2表达形成的聚集体与alpha/beta和epsilon亚型14-3-3蛋白有关,nsp2的高变区及羧基端尾巴与聚集体形成有关,这两个区域形成聚集体与alpha/beta、epsilon亚型的14-3-3蛋白有关。这些结果的发现为进一步研究PRRSV致病机制奠定基础,同时为研究防治PRRSV药物和疫苗设计提供理论依据。