全氟化合物(perfluorinated compounds, PFCs)是一类全氟性疏水线性碳链结合于多个亲水基团的化学物质,以其优良的化学稳定性和低表面自由能等,PFCs被广泛用于工业和生产消费领域。全氟辛烷磺酸盐(perfluorooctane sulfonate, PFOS, C8F17SO3-)作为PFCs的代表性化合物之一,它的前体物质和相关化合物更是被大量应用于纺织品、地毯、纸张、食物包装袋等生产中。由于全球性的广泛使用,化学结构中含有稳定的C-F键的PFOS虽然在环境介质中含量非常低(日本一城区空气监测浓度为5.6pg／m3；地表水中浓度<0.1μg／L),但通过食物链的生物放大作用,生物体中PFOS浓度要显著高于环境介质,如某类比目鱼肝脏中PFOS浓度为7,760μg／L湿重,普通人群血清中PFOS含量为20 ng/mL.目前PFOS引起的毒性效应如肝脏毒性、神经毒性、心血管毒性、生殖和发育毒性等得到广泛研究,PFOS暴露可引起斑马鱼胚胎出现剂量-和时间-依赖性的死亡率及畸形率增加,多种蛋白表达改变、促凋亡基因p53和Bax表达上调。整体动物实验也证实PFOS暴露可引起大鼠肝细胞肥大,脂肪空泡、总胆固醇降低。新生鼠神经发育过程中的自发性行为和习惯改变、胆碱能系统功能异常、蛋白表达改变等。此外,体外实验也显示PFOS可诱导HepG2细胞凋亡和DNA损伤、PC-12细胞向胆碱能表型分化等。虽然人们已经部分掌握PFOS引起毒性效应的信息,但对PFOS引起一般毒性作用的敏感指标尚待进一步研究,特别是PFOS引起的神经发育毒性体外研究报道甚少。目前虽认为宫内PFOS暴露可引起出生后不同时期新生鼠多个毒效应终点异常,但宫内较低剂量PFOS (2.0 mg/kg. bw)暴露是否引起相似组织形态学改变、有无可能通过活化脑组织胶质细胞而触发炎症反应和病理性凋亡尚未见报道。此外,PFOS引起脊椎模式生物斑马鱼胚胎发育毒性中,哪些因素可引起形态学改变成为值得探讨的问题。中枢神经系统(CNS)由神经元和非神经元细胞组成,后者包含胶质细胞和内皮细胞等,其中胶质细胞是CNS中数量上占绝对优势的细胞群体,神经胶质细胞构成神经系统框架,在中枢系统疾病研究中,胶质细胞的活化已成为CNS发生结构病变的病理特征之一。本文选择宫内暴露的新生鼠、斑马鱼胚胎和鼠类小胶质细胞株(N9细胞)作为研究对象,设想PFOS可能通过活化胶质细胞进而产生异常凋亡信号和炎症反应、改变miRNA和基因mRNA水平,干扰斑马鱼脑组织运动神经元发育和细胞增殖等方式发挥毒性作用,以探讨PFOS引起发育毒性的可能机制。第一部分宫内PFOS暴露对新生鼠肝、肺、大脑发育的影响目的：发育期大脑对各种外来刺激如外伤、缺氧、氧化应激等比成年后的脑组织更敏感,若此时大脑发育被阻滞,虽然自身有极轻微的修复功能,但损伤进程将持续进行并可能成为永久性损伤。本研究探讨宫内较低剂量PFOS暴露引起的大鼠组织病理学改变及中枢神经系统出现的潜在毒性效应。方法：将SD大鼠随机分为对照组和2.0 mg/kg/day PFOS组,选择4 ml//kg/day的0.5% Tween-20液作为对照,从母鼠受孕后第2日染毒至受孕后第21天管饲给药。出生后的仔鼠观察存活率及体重变化,然后麻醉使其安乐死,采用HE染色研究PFOS引起的主要脏器形态学的病理改变；免疫组织化学ABC染色法观察脑组织中小胶质细胞、星型胶质细胞的活性及有关分子表达；结果：与对照组0天仔鼠全部存活相比,实验组存活率仅88.7%(P＜0.01),体重下降明显(P＜0.001)。HE染色显示实验组肝脏出现局部缺血及红细胞渗出,肝索纹理不清,肝细胞形成多个空泡、巨核和多核,以上现象主要在肝门静脉周围周围。同时,实验组肺组织大量充血,肺间隔明显增厚,肺泡上皮及间质细胞增生,局部出现实变及轻微肺不张,与出生前的未成熟形态相似。首次发现实验组细小支气管管腔内被覆的上皮细胞核变大变圆,排列较紊乱,失去正常纤毛柱状上皮结构,呈现较幼稚细胞形态。脑组织仅见海马区细胞核比对照组染色深的现象。PFOS染毒后,反映小胶质细胞活性的ED-1和EMAP-Ⅱ与对照组相比无差别,星型胶质细胞被激活的标志物GFAP表达出现显著升高(P＜0.05),炎症因子AIF-1、参与炎症反应和凋亡发生的蛋白NFκB表达显著增加,而bak蛋白表达出现显著下调；结论：较低剂量PFOS主要引起肝、肺组织形态改变,通过诱发大鼠脑组织炎症反应以及病理学凋亡发挥损伤效应。第二部分PFOS诱导斑马鱼胚胎发育毒性及机制研究目的：斑马鱼因其易于饲养、发育快速、性成熟期短、胚胎体外发育、易于观察和操作等成为毒理学研究的重要模式脊椎动物之一。本部分拟探讨PFOS对斑马鱼胚胎神经和心脏发育的影响及可能的机制。方法：受精后6小时(6 hpf)的斑马鱼胚胎用1mg/L PFOS染毒至24,96,120,132,144,168和192 hpf, DMSO作为溶剂对照,实验中DMSO作为溶剂,其终浓度不超过0.0025%。观察不同时间点两组胚胎／幼鱼死亡率和畸形率；免疫组织化学方法测定a-tubulin和增殖性细胞核抗原(PCNA)表达；根据免疫组化结果提示,采用miRNA芯片筛选出神经发育相关miRNAs,并用stem-loop荧光定量PCR检测其表达；RT-PCR检测96和120 hpf时cdk5、Prdx 2和p53表达。吖啶澄(AO)染色检测凋亡细胞发生及其部位,根据miRNA芯片筛选结果用stem-loop荧光定量PCR检测心脏发育相关miRNAs表达。结果：PFOS染毒至132 hpf后明显增加斑马鱼胚胎死亡率和畸形率,可观察到多种发育畸形如心包水肿、卵黄囊水肿、脊柱弯曲、色素沉着降低、侧游等；α-tubulin分布结果显示对照组胚胎在72 hpf和120 hpf时脑区和近尾部2／3段脊柱区都存在高表达；与对照组相比,实验组72 hpf和120 hpf时脑区和近尾部2／3段脊柱区轴突束的表达显著降低,在躯干部分运动神经元轴突束表达变得细而短；但是96 hpf时脑区轴突束表达无明显差别,而近尾部2／3段脊柱区轴突束的表达出现显著增加。PCNA分布结果显示对照组72 hpf和96 hpf时,斑马鱼胚胎PCNA仅在腮弓或咽腭弓成点状表达模式,端脑、间脑、小脑等部位均未见表达,躯干脊柱区表达成细线状,而尾部脊柱区未见表达；120hpf时在咽腭弓区出现高表达,躯干脊柱区表达成细线状,同时可见肌原纤维节有一定量表达。与对照组相比,1 mg/L PFOS暴露后三个时间点下腹侧和尾部脊柱区PCNA表达均明显增加,此外,在120 hpf后脑区PCNA出现点状分布,而72 hpf和96 hpf时脑区未观察到明显PCNA表达。PFOS染毒至120 hpf引起特异性表达于脑组织,与神经发育相关的基因miR-124, miR-128, miR-153a/b均出现不同程度的上调,而miR-181b, miR-125b, miR-430家族表达下调。PFOS暴露至96 hpf和120 hpf参与神经发育调节的cdk5表达显著上调(P＜0.05),随后抑制过氧化物酶基因2表达的显著性下调,差异有统计学意义(P＜0.05)。AO染色显示PFOS诱导的凋亡细胞主要环绕在心脏周围,PFOS暴露至120 hpf引起心脏发育相关基因miR-138和miR-1表达显著性上调,而miR-133表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：PFOS可引起通过干扰运动神经元发育和神经细胞增殖、调节miRNAs和mRNA表达影响神经和心脏发育。第三部分PFOS诱导N9细胞凋亡及凋亡途径研究目的：多种外源性刺激引起的损伤可诱发病理性凋亡,凋亡发生有线粒体途径和死亡受体活化两种途径,其中线粒体功能失调是凋亡的核心检验点,线粒体膜通透性增加引起线粒体内膜区细胞色素c释放,随后启动caspase级联效应。体外实验已证实PFOS染毒使PC-12细胞向胆碱能表型分化,但未见PFOS引起小胶质细胞的凋亡的报道。本研究以小胶质细胞系(N9)作为靶细胞,观察PFOS通过线粒体途径诱发N9细胞的凋亡效应。方法：设定5,10,50,100,200μmol/L五个PFOS实验组,对照组为DMSO溶剂,各组中溶剂DMSO终浓度不超过0.5%(v／v)。用MTT法观察染毒24 h和48 h后细胞活力；PFOS染毒24 h后用PI/FDA双染、Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态,流式细胞术定量分析凋亡细胞率；罗丹明123检测线粒体膜电位变化,荧光定量PCR检测染毒24 h和48 h后凋亡相关基因p53、Bax、Bcl-2、caspase3和caspase 9基因表达。结果：PFOS能显著降低N9细胞活力,同一浓度下染毒48 h后活力下降比24 h更明显。形态学结果显示PFOS引起剂量-依赖性的凋亡细胞增加,凋亡率检测也证实5～200μmol/L PFOS染毒引起的凋亡细胞率分别为3.97%、8.32%、20.81%、33.26%、48.72%,与对照组(2.24%)相比,50μmol/L及更高剂量PFOS引起的凋亡增加具有统计学意义。此外,PFOS染毒降低了线粒体膜电位,实验组细胞出现明显的核周小斑点状荧光。凋亡发生有多个基因的参与,本研究显示随剂量的增加,实验组p53、Bax、caspase 3和caspase 9基因水平呈上升趋势,Bcl-2表达水平呈下降趋势,但没有浓度依赖性。结论：PFOS主要通过线粒体途径及相关基因表达改变诱导神经细胞凋亡