流行性感冒是由流感病毒引起的具有急性传染性的呼吸道疾病，常引起地方性甚至全球性流行。流感病毒血凝素（hemagglutinin，H）和神经氨酸酶（neuraminidase，N）具有变异特性，由于不断进化以及新的突变株的出现，引起人们对这些病毒可能引起人类流感流行的担忧。猪在流感流行病学中被认为有流感病毒基因重组或重排的“混合器”的作用，与人类流感流行密切相关得到人们高度重视。流感病毒主要侵害呼吸系统，引起急性肺损伤，其致病机制有多种，且纵横交织，相互作用。但有研究表明，氧化应激和TLR4信号转导通路是导致急性肺损伤的关键途径。基于此，研究抗氧化应激及相关信号通路对病毒诱导急性肺损伤的作用，筛选安全有效的抗病毒、抗应激反应药物成为目前研究防治流感病毒的个切入点。研究发现，人参皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1，G-Rb1）在许多炎症损伤疾病中有抗氧化、清除自由基、提高机体免疫力等作用，但G-Rb1是否对病毒诱导的急性肺损伤具有保护作用，文献鲜见报道。因此，探讨G-Rb1对病毒诱导的急性肺损伤自由基与相关酶的影响，以及对TLR4信号转导通路的作用，就具有重要的研究意义。基于上述研究背景及分析，本研究以A/swine/HeBei/012/2008（/H9N2（）H9N2-SIV）病毒诱导小鼠建立急性肺损伤模型，通过对肺组织自由基、酶的测试，探讨G-Rb1对氧化应激致急性肺损伤的影响；通过对TLR4在肺组织中的表达测试，分析TLR4信号转导通路在急性肺损伤中的作用及G-Rb1对其影响，为探讨G-Rb1在病毒诱导急性肺损伤中作用提供理论指导。1．病毒诱导急性肺损伤模型复制：将实验保存的H9N2-SIV通过鸡胚培养扩增，并进行半数致死量（LD50）测定。用灭菌生理盐水5倍稀释的含有H9N2-SIV的鸡胚尿囊液经鼻腔接种SPF级BALB/c小鼠，接种剂量为每只0.1mL（约含1×10-3LD50），分别在2、4、6、8、14d取肺组织，称重测定肺系数，大体解剖学观察后取左肺同部位做组织切片，HE染色，右肺做湿干质量比，综合评估肺损伤指标；在同时间点，取小鼠心室动脉血，做血气分析，判断机体是否存在酸碱平衡失调以及缺氧和缺氧程度等，做为急性肺损伤的辅助判断；试验全过程记录生存情况，并统计累积生存率。结果显示，从第3d开始呼吸极度困难，呼吸音明显，采集量及体质量下降明显并出现死亡，解剖可见肺明显水肿、出血，体积增大。肺湿干质量比和肺系数从第2d开始明显增加，第6d达最高，第8d下降。HE染色切片观察，第2d出现肺泡、细支气管和小血管周围间质水肿，炎性细胞及渗出物，第4d出现间质性肺炎病变，肺泡腔变小，出血，第6d炎性细胞渗出，形成支气管肺炎。血气分析结果显示，血氧分压降低且二氧化碳分压升高，出现严重的低氧血症，氧交换不足，通气功能出现障碍；综合上述指标，判定造模成功。2．通过对肺组织中氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、羟自由基（OH）等氧自由基及氧化产物的测试，探讨G-Rb1对H9N2-SIV诱导的氧化应激致小鼠急性肺损伤的影响。实验设三组：对照组鼻腔接种0.1mL含正常鸡胚尿囊液；急性肺损伤组（ALI组）鼻腔接种0.1mL含1×10-3LD50病毒鸡胚尿囊液；人参皂苷Rb1组（G-Rb1组）经鼻腔接种0.1mL含1×10-3LD50病毒鸡胚尿囊液后口服0.1mL人参皂苷Rb1（按10mg·Kg-1bw），连用7d。分别在2、4、6、8、14d取肺组织，计算肺湿干质量比及肺系数，大体解剖学及病理组织学（HE染色组织切片）观察，进行生存分析，测定NO、MDA及抑制OH能力。结果表明：ALI组小鼠临床症状、大体解剖学及病理组织学观察与复制模型出现的结果相似，G-Rb1组症状明显轻于ALI组。ALI组累积生存率从第3d的66.7%，逐渐下降至第5d26.7%，G-Rb1组累积生存率则从第4d的80%逐渐降至第6d53.3%，明显使死亡时间延迟（P<0.05），死亡率降低；肺湿干质量比，感染后的第2~6d，ALI组与G-Rb1组的肺湿干质量比均呈逐渐上升趋势，ALI组与对照组相比，肺湿干质量比极明显增加（P<0.01），G-Rb1组与对照组比，肺湿干质量比也有极明显增加（第4～6d，P<0.01），G-Rb1组与ALI组比，W/D明显小于ALI组（P<0.05）；感染后的第８d开始小鼠逐渐恢复，W/D呈下降的趋势，但与对照组相比仍差异有显著性（P<0.01）；而G-Rb1组与ALI组比，差异极显著。至感染后的第14d，各组肺湿干比接近正常。肺系数与肺湿干质量比类似，只是第2d两组与对照组比均无明显差异。从第2d开始至第6d，各实验组与对照组比，NO含量增加极显著（P<0.01），且NO含量呈上升趋势，第8d开始下降。ALI组与G-Rb1组组间差异极显著（P<0.01）。与对照组比，MDA含量变化及抑制OH能力同NO有样的趋势，在第4d至第6d组间差异有显著的统计学意义（P<0.01），ALI组明显高于G-Rb1组。第14d，两试验组NO、MDA含量及抑制OH能力趋于正常。3．在同样时间点，测定总过氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、髓过氧化物酶（MPO）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力变化，评估G-Rb1对病毒诱导急性肺损伤小鼠肺组织相关酶活力的影响，检测G-Rb1对氧化应激致小鼠肺损伤的保护作用。结果显示：从感染后第2d开始至第6d，ALI组与G-Rb1组的T-SOD活力呈下降趋势，第8d开始回升。第2dG-Rb1组与对照组比，T-SOD活力显著下降（P<0.05）。从第4d到第8d，各实验组与对照组比下降极明显（P<0.01），至第14d，已无明显差异。但第4d和第6d，G-Rb1组T-SOD活力要显著高于ALI组（P<0.01）；从第2d开始至第6d，ALI组与G-Rb1组CAT活力呈下降趋势，第8d开始回升，与对照组比，第4、6、8d降低明显（P<0.01）；但G-Rb1组活性要比ALI组高，差异有显著的统计学意义（P<0.01）；从第2d开始至第14d，ALI组GSH-PX活力显著降低（P<0.01），而G-Rb1组则显著升高（P<0.01），组间比，G-Rb1组GSH-PX活性要比ALI组高，差异有显著的统计学意义（P<0.01）。与对照组比，ALI组MPO活力变化从第2~6d有显著提高（P<0.01），第8~14d逐渐降低，但仍高于对照组。G-Rb1组MPO活力变化与ALI组相似，与对照组比在第4、6、8d有显著提高（P<0.01），但提高程度比ALI组低（P<0.05）。4．应用免疫印迹（Western blot）与实时定量PCR（qRT-PCR）技术分别测定TLR4蛋白水平和TLR4mRNA在肺组织中表达，探讨G-Rb1对TLR4信号转导通路参与氧化应激致急性肺损伤的影响。结果表明：从第4d至第6d，ALI组和G-Rb1组TLR4mRNA的表达呈明显的上升趋势，均高于对照组，有显著的统计学意义（P<0.01），G-Rb1组表达低于ALI组，有显著的统计学意义（P<0.05）；第8d两组均有所下降，但与对照组比仍有显著的统计学意义（P<0.01），G-Rb1组明显低于ALI组，具有显著的统计学意义（P<0.01）；至第14d，两组已趋于正常。TLR4蛋白的表达和TLR4mRNA的表达在趋势上基本致。ALI组与G-Rb1组小鼠肺组织内TLR4蛋白表达在感染后第4～8d明显增强，呈明显的上升趋势，与对照组相比差异显著（P<0.01）；第8d后开始下降，至第14d趋于正常。组间比，G-Rb1组在第4～8d的TLR4蛋白表达明显要低于ALI组，有显著的统计学意义（P<0.01）。综上所述，A/Swine/Hebei/012/2008（H9N2）病毒株能感染BALB/c小鼠致急性肺损伤；氧化应激反应是造成急性肺损伤的主要原因之。活性氧自由基如NO、OH等过度释放，引起氧化应激反应，造成肺组织损伤。G-Rb1能清除活性氧自由基OH，抑制活性氧自由基NO的产生；G-Rb1能调控酶反应系统，平衡氧化应激产生的自由基，能提高SOD、GSH-PX和CAT活性，抑制MPO活性；TLR4信号通路同样参与病毒诱导的氧化应激致急性肺损伤反应过程，G-Rb1能减少TLR4蛋白及TLR4mRNA的表达。G-Rb1在定程度上缓解流感病毒诱导的小鼠氧化应激肺损伤。