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流行性感冒是由流感病毒引起的具有急性传染性的呼吸道疾病,常引起地方性甚至全球性流行。流感病毒血凝素(hemagglutinin,H)和神经氨酸酶(neuraminidase,N)具有变异特性,由于不断进化以及新的突变株的出现,引起人们对这些病毒可能引起人类流感流行的担忧。猪在流感流行病学中被认为有流感病毒基因重组或重排的“混合器”的作用,与人类流感流行密切相关得到人们高度重视。流感病毒主要侵害呼吸系统,引起急性肺损伤,其致病机制有多种,且纵横交织,相互作用。但有研究表明,氧化应激和TLR4信号转导通路是导致急性肺损伤的关键途径。基于此,研究抗氧化应激及相关信号通路对病毒诱导急性肺损伤的作用,筛选安全有效的抗病毒、抗应激反应药物成为目前研究防治流感病毒的个切入点。研究发现,人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1,G-Rb1)在许多炎症损伤疾病中有抗氧化、清除自由基、提高机体免疫力等作用,但G-Rb1是否对病毒诱导的急性肺损伤具有保护作用,文献鲜见报道。因此,探讨G-Rb1对病毒诱导的急性肺损伤自由基与相关酶的影响,以及对TLR4信号转导通路的作用,就具有重要的研究意义。基于上述研究背景及分析,本研究以A/swine/HeBei/012/2008(/H9N2()H9N2-SIV)病毒诱导小鼠建立急性肺损伤模型,通过对肺组织自由基、酶的测试,探讨G-Rb1对氧化应激致急性肺损伤的影响;通过对TLR4在肺组织中的表达测试,分析TLR4信号转导通路在急性肺损伤中的作用及G-Rb1对其影响,为探讨G-Rb1在病毒诱导急性肺损伤中作用提供理论指导。1.病毒诱导急性肺损伤模型复制:将实验保存的H9N2-SIV通过鸡胚培养扩增,并进行半数致死量(LD50)测定。用灭菌生理盐水5倍稀释的含有H9N2-SIV的鸡胚尿囊液经鼻腔接种SPF级BALB/c小鼠,接种剂量为每只0.1mL(约含1×10-3LD50),分别在2、4、6、8、14d取肺组织,称重测定肺系数,大体解剖学观察后取左肺同部位做组织切片,HE染色,右肺做湿干质量比,综合评估肺损伤指标;在同时间点,取小鼠心室动脉血,做血气分析,判断机体是否存在酸碱平衡失调以及缺氧和缺氧程度等,做为急性肺损伤的辅助判断;试验全过程记录生存情况,并统计累积生存率。结果显示,从第3d开始呼吸极度困难,呼吸音明显,采集量及体质量下降明显并出现死亡,解剖可见肺明显水肿、出血,体积增大。肺湿干质量比和肺系数从第2d开始明显增加,第6d达最高,第8d下降。HE染色切片观察,第2d出现肺泡、细支气管和小血管周围间质水肿,炎性细胞及渗出物,第4d出现间质性肺炎病变,肺泡腔变小,出血,第6d炎性细胞渗出,形成支气管肺炎。血气分析结果显示,血氧分压降低且二氧化碳分压升高,出现严重的低氧血症,氧交换不足,通气功能出现障碍;综合上述指标,判定造模成功。2.通过对肺组织中氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、羟自由基(OH)等氧自由基及氧化产物的测试,探讨G-Rb1对H9N2-SIV诱导的氧化应激致小鼠急性肺损伤的影响。实验设三组:对照组鼻腔接种0.1mL含正常鸡胚尿囊液;急性肺损伤组(ALI组)鼻腔接种0.1mL含1×10-3LD50病毒鸡胚尿囊液;人参皂苷Rb1组(G-Rb1组)经鼻腔接种0.1mL含1×10-3LD50病毒鸡胚尿囊液后口服0.1mL人参皂苷Rb1(按10mg·Kg-1bw),连用7d。分别在2、4、6、8、14d取肺组织,计算肺湿干质量比及肺系数,大体解剖学及病理组织学(HE染色组织切片)观察,进行生存分析,测定NO、MDA及抑制OH能力。结果表明:ALI组小鼠临床症状、大体解剖学及病理组织学观察与复制模型出现的结果相似,G-Rb1组症状明显轻于ALI组。ALI组累积生存率从第3d的66.7%,逐渐下降至第5d26.7%,G-Rb1组累积生存率则从第4d的80%逐渐降至第6d53.3%,明显使死亡时间延迟(P<0.05),死亡率降低;肺湿干质量比,感染后的第2~6d,ALI组与G-Rb1组的肺湿干质量比均呈逐渐上升趋势,ALI组与对照组相比,肺湿干质量比极明显增加(P<0.01),G-Rb1组与对照组比,肺湿干质量比也有极明显增加(第4~6d,P<0.01),G-Rb1组与ALI组比,W/D明显小于ALI组(P<0.05);感染后的第8d开始小鼠逐渐恢复,W/D呈下降的趋势,但与对照组相比仍差异有显著性(P<0.01);而G-Rb1组与ALI组比,差异极显著。至感染后的第14d,各组肺湿干比接近正常。肺系数与肺湿干质量比类似,只是第2d两组与对照组比均无明显差异。从第2d开始至第6d,各实验组与对照组比,NO含量增加极显著(P<0.01),且NO含量呈上升趋势,第8d开始下降。ALI组与G-Rb1组组间差异极显著(P<0.01)。与对照组比,MDA含量变化及抑制OH能力同NO有样的趋势,在第4d至第6d组间差异有显著的统计学意义(P<0.01),ALI组明显高于G-Rb1组。第14d,两试验组NO、MDA含量及抑制OH能力趋于正常。3.在同样时间点,测定总过氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、髓过氧化物酶(MPO)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力变化,评估G-Rb1对病毒诱导急性肺损伤小鼠肺组织相关酶活力的影响,检测G-Rb1对氧化应激致小鼠肺损伤的保护作用。结果显示:从感染后第2d开始至第6d,ALI组与G-Rb1组的T-SOD活力呈下降趋势,第8d开始回升。第2dG-Rb1组与对照组比,T-SOD活力显著下降(P<0.05)。从第4d到第8d,各实验组与对照组比下降极明显(P<0.01),至第14d,已无明显差异。但第4d和第6d,G-Rb1组T-SOD活力要显著高于ALI组(P<0.01);从第2d开始至第6d,ALI组与G-Rb1组CAT活力呈下降趋势,第8d开始回升,与对照组比,第4、6、8d降低明显(P<0.01);但G-Rb1组活性要比ALI组高,差异有显著的统计学意义(P<0.01);从第2d开始至第14d,ALI组GSH-PX活力显著降低(P<0.01),而G-Rb1组则显著升高(P<0.01),组间比,G-Rb1组GSH-PX活性要比ALI组高,差异有显著的统计学意义(P<0.01)。与对照组比,ALI组MPO活力变化从第2~6d有显著提高(P<0.01),第8~14d逐渐降低,但仍高于对照组。G-Rb1组MPO活力变化与ALI组相似,与对照组比在第4、6、8d有显著提高(P<0.01),但提高程度比ALI组低(P<0.05)。4.应用免疫印迹(Western blot)与实时定量PCR(qRT-PCR)技术分别测定TLR4蛋白水平和TLR4mRNA在肺组织中表达,探讨G-Rb1对TLR4信号转导通路参与氧化应激致急性肺损伤的影响。结果表明:从第4d至第6d,ALI组和G-Rb1组TLR4mRNA的表达呈明显的上升趋势,均高于对照组,有显著的统计学意义(P<0.01),G-Rb1组表达低于ALI组,有显著的统计学意义(P<0.05);第8d两组均有所下降,但与对照组比仍有显著的统计学意义(P<0.01),G-Rb1组明显低于ALI组,具有显著的统计学意义(P<0.01);至第14d,两组已趋于正常。TLR4蛋白的表达和TLR4mRNA的表达在趋势上基本致。ALI组与G-Rb1组小鼠肺组织内TLR4蛋白表达在感染后第4~8d明显增强,呈明显的上升趋势,与对照组相比差异显著(P<0.01);第8d后开始下降,至第14d趋于正常。组间比,G-Rb1组在第4~8d的TLR4蛋白表达明显要低于ALI组,有显著的统计学意义(P<0.01)。综上所述,A/Swine/Hebei/012/2008(H9N2)病毒株能感染BALB/c小鼠致急性肺损伤;氧化应激反应是造成急性肺损伤的主要原因之。活性氧自由基如NO、OH等过度释放,引起氧化应激反应,造成肺组织损伤。G-Rb1能清除活性氧自由基OH,抑制活性氧自由基NO的产生;G-Rb1能调控酶反应系统,平衡氧化应激产生的自由基,能提高SOD、GSH-PX和CAT活性,抑制MPO活性;TLR4信号通路同样参与病毒诱导的氧化应激致急性肺损伤反应过程,G-Rb1能减少TLR4蛋白及TLR4mRNA的表达。G-Rb1在定程度上缓解流感病毒诱导的小鼠氧化应激肺损伤。