类胡萝卜素是一类脂溶性的类异戊二烯色素,能够在植物、真菌、藻类和某些细菌中呈现黄色、橘色和红色等。自然界中存在超过600种的类胡萝卜素,但是用于工业化生产的仅仅包括番茄红素、β-胡萝卜素、角黄素和虾青素等。由于它们对于人类的健康有益,在食品、化妆品、医药行业等领域都受到了广泛的关注。类胡萝卜素通常是通过化学合成的方式获得,但是越来越多对天然产物的需求使科学家们关注于天然来源的菌株改造,以及通过代谢工程的手段对大肠杆菌、酿酒酵母等进行基因改造进行类胡萝卜素的生物合成。近年来,解脂耶氏酵母作为一种非常规酵母受到广泛关注,特别是以乙酰辅酶A,脂肪酸和脂质等作为来源的一些化合物的生产,它被认为是一种安全的菌株,已被用于多种高附加值生物化学制品的生产。本研究选用解脂耶氏酵母菌株作为底盘菌,通过合成生物学、代谢工程及发酵优化等手段对其进行改造,使其成为能够高产类胡萝卜素的工程菌株,为类胡萝卜素的工业化生产提供新的方向,主要分为以下四点研究内容:一、探究以解脂耶氏酵母为底盘菌进行类胡萝卜素生产,首先选取番茄红素作为目标产物。将成团泛菌来源的GGPP合成酶基因crtE,八氢番茄红素合成酶基因crtB和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI在解脂耶氏酵母Polf中表达,成功构建了可异源合成番茄红素的解脂耶氏酵母菌株,番茄红素的初始产量为8.5 mg/L。之后探究了番茄红素合成基因拷贝数、一系列中心代谢基因过表达对番茄红素产量的影响,发现将crtI基因以多拷贝的整合方式,而crtE和crtB基因以单拷贝整合的方式能极大的提高番茄红素的产量,达到124 mg/L,在此基础上,AMPD基因的过表达能够将番茄红素的产量提高三倍,在摇瓶中的生产水平达到371 mg/L。将获得的最优的番茄红素异源生产的解脂耶氏酵母基因工程菌在5 L的发酵罐中进行分批补料发酵,番茄红素经过4天的发酵最终的产量为745 mg/L。二、在构建番茄红素的生产菌株时,采用的是整合型质粒进行基因的整合,导致后续继续进行下游β-胡萝卜素和虾青素等的菌株构建时,需要重复的质粒构建工作和酵母转化,增加了工作量,而且整合基因的数目也会受到限制。目前,针对于解脂耶氏酵母已经成功的开发了 CRISPR/Cas9系统,但是仅仅筛选到五个位点用于基因的整合,对于后续进一步进行类胡萝卜素的生物合成位点依旧不足,因此在此系统的基础上,本章节筛选到了 20个可用于基因敲入的整合位点,成功的构建相应的sgRNA和donor质粒对。这些位点包括敲除后有助于油脂积累的位点（POX1,POX2,POX3,POX4,POX5,POX6,GUT2,PEX10,LIP1）,假基因位点（E1,A1,B1,A2,F1,E2,F2,C1）和木糖代谢的位点（XLK,XYR,XDH）。三、使用CRISPR/Cas9系统在解脂耶氏酵母中进一步探究β-胡萝卜素及虾青素的异源生产菌株的构建。将经过密码子优化之后的卷枝毛霉来源的八氢番茄红素脱氢酶基因carB和八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶基因carRP在解脂耶氏酵母Polf中表达,成功构建了可异源合成β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母菌株,β-胡萝卜素的初始产量为17.1 mg/L。将编码GGPP合成酶基因GGS1和编码HMG-CoA还原酶基因HMG过表达,使β-胡萝卜素的产量提高到57.3 mg/L。本研究继续通过增强MVA途径,过表达对番茄红素产量提高有关的AMPD基因提高乙酰辅酶A流量,增加carRP和carB基因的拷贝数三个方面在摇瓶水平来探究β-胡萝卜素产量提高的方法,结果表明通过将carRP和carB基因的多拷贝表达,以及编码HMG-CoA合成酶基因ERG13的过表达,最终胡萝卜素的产量达到168.1 mg/L。然而,将编码角鲨烯合成酶的基因SQS的表达水平进行了下调,却没有达到预期的效果。最终获得的菌株一共过表达了 8个基因,分别为三个拷贝的carRP基因,两个拷贝的carB基因,一个拷贝GGS1基因,一个拷贝HMG基因,一个拷贝ERG13基因。为了得到高浓度的β-胡萝卜素产量,工程菌株在发酵过程中必须能达到高浓度的生物量水平,但是通过CRISPR/Cas9整合方式获得的上述菌株是尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型的菌株,不利于高密度发酵,因此,将这两个筛选标记进行回补,最后生物量显著提高,同时胡萝卜素的产量达到407.7 mg/L。将获得的最优的β-胡萝卜素异源生产的解脂耶氏酵母基因工程菌在5 L的发酵罐中进行连续补料发酵,β-胡萝卜素经过6.5天的发酵最终的产量为4.5 g/L,该产量能够满足目前工业化的生产水平。四、基于构建的高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母工程菌株,进一步在该菌株中进行虾青素生产的异源构建,本论文着重对β-胡萝卜素羟化酶基因的来源进行了筛选,最终发现将来自于海洋细菌副球菌N81106中编码β-胡萝卜素酮化酶的PspcrtW基因和来自于雨生红球藻中编码β-胡萝卜素羟化酶的HpcrtZ基因共表达,虾青素的产量能够达到61.3 mg/L,该产量是目前在解脂耶氏酵母中进行虾青素生产的最高产量。本研究以解脂耶氏酵母作为出发菌株,探索在该菌株中进行高效生产类胡萝卜素的策略,通过基因操作和发酵优化等操作手段成功构建了能够高效生产番茄红素、β-胡萝卜素和虾青素的工程菌株。本文中系统的菌株改造策略深入的探究了在解脂耶氏酵母中如何异源构建并增强类胡萝卜素生物合成途径,从而促进类胡萝卜素在该菌株中的合成效率,而且本研究的策略及思路,也为在解脂耶氏酵母中进行其他的萜类物质的生产提供了一定的参考价值。