背景与目的：脑出血是目前人们致残的主要原因。除血肿本身引起的急性机械性脑组织损伤外，出血灶及血肿周围脑组织的炎症反应以及脑水肿导致血肿周边脑组织的继发性损伤。目前，关于脑出血的治疗仍局限于内科支持治疗以及侵袭性外科手术处理，对于伴有严重神经系统功能缺损的脑出血幸存患者，仍缺乏有效的治疗手段，来改善或治愈他们的症状，增强生活的自信心，提高生活质量，减轻家庭、社会负担。长期以来，由于缺乏有效的模拟脑出血自然过程的动物模型，严重制约了人们在脑出血的病理生理机制、神经功能的恢复以及相关的治疗策略等方面的研究。1996年，Del Bigio及其同事对Rosenberg的胶原酶诱导脑出血模型方法进行改进。他们将含胶原酶(Ⅶ型)与肝素的生理盐水在立体定位下注入大鼠尾状核，成功地诱发了脑出血。血肿形成快速，形态一致，大小重复性好。该模型已经成为目前脑出血研究中使用的最多的一种脑出血动物模型，可用于检验针对可能造成脑出血后脑损伤的三个过程：脑水肿、炎症反应与缺血半暗带的治疗方法的研究。自我更新和多分化潜能是神经干细胞的两个基本属性；并且，神经干细胞对颅内病理改变具有强大的特异的趋向性。因此，研究人员尝试应用外源性NSCs移植修复、替代脑出血缺失的神经组织细胞或与宿主脑内的细胞相互作用。然而，目前关于神经干细胞的移植方法及移植时间仍存在争议。脑实质内单个或多个位点直接注射的移植方法，易造成局部脑损伤；移植的细胞集中在注射局部脑组织内，不利于细胞在脑组织内的分布；另外，细胞暴露于病灶的炎性环境中，存活率明显降低。脑室内移植可使细胞较为广泛分布于脑内，但创伤较大而且必须克服血脑屏障及脑脊液-脑屏障的限制。经尾静脉神经干细胞移植，简单易于操作、侵袭性小，移植的细胞能够特异性的迁移到病理位置。首过效应，细胞被中枢神经系统以外的组织所摄取，以及随血液循环时长时间暴露于网状内皮及免疫系统，导致其移植效率降低。另外，经皮颈动脉注射能够高效的将药物导入局部病灶，易于操作、并且创伤小。因此在本实验中，我们将体外扩增的BrdU标记的鼠胎脑神经干细胞，通过颈动脉注射入胶原酶(Ⅶ型)／肝素诱导建立的脑出血动物模型，研究颈动脉神经干细胞移植对脑出血的治疗作用和细胞移植效率，从而寻找一个高效的、侵袭性较小的神经干细胞的移植方法。由于在脑出血的急性期，大量的细胞死亡、出血和炎性反应的神经毒性作用，不利于移植细胞的存活。同时，严重的炎症反应导致病灶周围脑组织内产成大量的细胞因子，其中包括一些诱导向星形胶质细胞方向分化的因子，如IL-1、IL-6、TNF和CNTF。而在炎症反应的慢性期移植，囊腔和胶质瘢痕的逐渐形成会阻碍NSCs进入受损组织周围。因此，关于神经干细胞移植的时间，我们分别在大鼠脑出血后2、7、14、28天进行移植，探寻一个最适移植治疗时间窗。实验方法：1．取孕14天的Wistar胎鼠，解剖显微镜下取出胚胎大鼠大脑皮层。0.25％胰蛋白酶／0.02％EDTA(1∶1)消化后，吸管轻轻吹打，使大部分组织块分散成单个细胞或小细胞团状态。离心后，弃上清，洗涤沉淀细胞2次。加入神经干细胞完全培养液，台盼蓝活细胞计数，以1×10~5cells／ml浓度进行神经干细胞原代培养。分别采用机械分离与胰酶消化神经球的分离方法进行NSCs传代培养，台盼蓝活细胞计数测定分离后细胞存活率，观察不同传代方法对神经干细胞的损伤作用。绘制神经干细胞生长曲线，计算细胞倍增时间，研究不同传代方法对神经干细胞增殖能力的影响。采用机械分离或胰酶消化的方法连续传代、长期稳定培养神经干细胞，计算细胞增殖率，比较研究长期培养条件下，不同传代方法对神经干细胞增殖率的影响。取第4代、8代、12代、20代以及30代，稳定的机械分离传代培养的神经干细胞球接种到24孔培养板中的盖玻片上，加入神经干细胞分化培养液进行分化培养，研究长期培养条件下神经干细胞的神经发生能力的变化。2．50只Wistar大鼠随机分为试验组和生理盐水对照组。实验组25只大鼠，应用立体定向纹状体内注射胶原酶(Ⅷ型)／肝素方法建立ICH模型。10％水合氯醛腹腔注射麻醉，应用微量注射泵将0.7μl生理盐水／0.14UⅣ型胶原酶／1.4U肝素缓缓注射入尾状核内(冠状缝后0.2mm，外侧3.0mm，腹侧6.0mm)。生理盐水对照组25只大鼠，仅接受脑内注入等量生理盐水。手术后2小时及每天对实验组和对照组大鼠进行行为功能测试，检测其神经功能缺损情况。术后1天，3天，5天，7天，实验组与对照组分别处死5只大鼠，断头取脑，距离针道前后2mm冠状切取脑组织，观察血肿形态、水肿情况，计算脑组织含水量。试验结束后，处死各组最后5只大鼠；常规HE染色，观察出血脑组织显微病理改变。3．取稳定培养传至4-6代的神经干细胞，移植前三天于培养基中添加BrdU(5μmol／l)标记细胞，用于追踪迁移、存活于宿主体内的移植细胞。移植前收集神经干细胞球，胰酶消化分离为单细胞，重悬为1×10~4cells／μl的细胞悬液以备移植。取胶原酶(Ⅶ型)／肝素诱导建立的48只Wistar大鼠ICH模型，随机分为实验组和对照组。实验组大鼠分别在ICH后2、7、14、21、28天进行颈动脉NSCs移植(400μl DMEM，含4×10~6NSCs)。对照组8只大鼠，仅接受颈动脉内注入等量DMEM培养液。脑出血后1天和移植后每周对实验组和对照组大鼠进行行为功能评价。于脑出血后2月处死所有动物，断头取脑，冰冻切片，行免疫荧光单、双标染色鉴别移植来源的细胞，观察细胞迁移、分布及分化情况。计算机辅助计数(ImagePro；Media Cybergenics，Silver Spring，MD)脑组织内的BrdU阳性移植细胞，半定量计算宿主脑内的移植细胞数以及来源于移植细胞的MAP-2、GFAP阳性细胞数。行HE染色测定各组大鼠脑出血病灶体积大小，评估神经干细胞移植后对脑出血病灶大小改变的影响。实验结果：1．原代和传代培养的细胞球呈nestin阳性，并且能够分化为MAP-2阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞及MBP阳性的少突胶质细胞，证实成功培养获得具备自我更新和多向分化能力的神经干细胞。与胰酶消化法进行神经干细胞球传代相比，逐步减小吸管口径机械分离大细胞球为小细胞球和单细胞的传代方法，传代后细胞存活率高(p＜0.05)，细胞倍增时间短，增殖能力强。体外长期培养条件下，随着培养时间的延长，神经干细胞分化为神经元的比例逐渐降低，星形胶质细胞的比例逐渐增高；然而，在4代到12代之间神经干细胞分化为神经元的能力虽然表现出下降的趋势，但仍较为稳定，培养至12代之后，神经元的分化比例迅速下降，星形胶质细胞的比例迅速上升。2．实验组大鼠术后左侧肢体瘫痪，前后肢行动迟缓，抓持能力减弱，活动时向右侧旋转和／或左侧倾倒，穿越横梁时，行动时间显著延长或不能穿越掉下横梁，24小时之内功能缺损达到顶峰。与之相比，对照组大鼠术后仅可见轻微功能损害，于1天之内逐渐恢复。两组之间存在显著统计学差异(p＜0.0001)。术后第一天，实验组大鼠右侧尾状核区形成一明显圆形或椭圆形的血肿，血肿周边有一狭窄而不规则的水肿带。术后2-4天时，周围水肿十分明显，随后逐渐减轻。对照组大鼠仅术后最初2天可见注射点周围较狭窄范围轻微水肿，未观察到血肿形成。实验组大鼠脑组织含水量显著高于对照组大鼠脑组织含水量(p＜0.001)脑组织切片HE染色，实验组大鼠血肿区内充满大量的红细胞，其中可见血肿破坏脑组织；血肿周围的脑组织疏散，细胞水肿，星形胶质细胞肿胀，神经细胞变性坏死，很多中性粒细胞、小胶质细胞充盈其中。对照组大鼠未见明显异常。3．脑出血后第9周始，与对照相比，NSCs移植组大鼠行为功能改善明显(ANOVA p＜0.05)，SNK检验显示，脑出血第7天移植组在移植后第3周和ICH后第9周的行为功能评分显著优于其他时间移植组(p＜0.05)；在同一时间点上，ICH后第2天和第14天接受移植大鼠行为功能评分低于晚期接受移植组，而第14天接受移植组大鼠行为功能改善又好于第2天接受移植组大鼠(p＜0.05)；第21和第28天移植组大鼠未见明显治疗效果(p＞0.05)，两组间亦未有显著性差异(p＞0.05)。BrdU标记的移植细胞迁移进入并存活于宿主脑内；并且绝大多数移植细胞选择性的靶向迁移到损伤区，较为均匀的分布于血肿周边脑组织；少数细胞分布于对侧半球及同侧正常脑组织内。迁移并存活于宿主脑内的BrdU阳性移植细胞数量取决于移植时间。ICH后第7天和第14天移植组BrdU阳性细胞计数显著多于ICH后第2天、第21天和第28天移植组，且第7天移植组多于第14天移植组。移植的BrdU阳性细胞分化为GFAP阳性星形胶质细胞和MAP-2阳性神经元，未观察到移植细胞分化为MBP阳性少突胶质细胞。细胞的分化方向与移植时间明显相关。与其他时间移植的细胞相比，ICH后第2天移植的NSCs绝大部分分化为星形胶质细胞(84.5±7.6％)，少部分细胞分化为神经元(8.6±1.3％)；而ICH后第21和27天移植的NSCs分化为神经元的比例明显增大(35.4±3.1％，37.2±4.1％)，分化为星形胶质细胞的比例相应减少(52.1±6.5％，50.3±5.7％)。然而，7-14天移植组，分化为神经元的绝对数量显著高于其它治疗组(p＜0.0001)。与对照相比，移植组大鼠病灶体积未见明显缩小(p＞0.05)，提示NSCs移植在脑出血后第8周未能有效修复病灶体积。结论：1．与胰酶消化法相比，应用逐步减小吸管口径机械分离大细胞球为小细胞球和单细胞的分离传代方法，减少了传代对细胞的损伤，保证了大部分细胞间连接的完整性，显著增强神经干细胞的增殖能力。体外长期扩增的神经干细胞，由于微环境和／或自身基因的调控，随着传代的延续，其神经发生能力逐渐降低：分化为神经元的比例逐渐减少，分化为星形胶质细胞的比例逐渐增加。2．Ⅶ型胶原酶／肝素尾状核内立体定向注射的方法，制作ICH动物模型，术后大鼠产生明显的、长期行为功能障碍，不同的个体之间神经病学评分差距较小，并且血肿形态较为一致，对于研究脑出血后神经功能的恢复和治疗疗效评价有利。3．由于脑出血后病灶周围血脑屏障的破坏、细胞因子的表达；颈动脉注射后局部细胞浓度梯度的作用以及神经干细胞对颅内病理改变的趋向作用，经皮颈动脉神经干细胞移植能够靶向的、高效的将神经干细胞移植至病灶周围，并且创伤小、手术简单易于操作。神经干细胞移植时间影响移植后宿主脑内存活干细胞数量、分布和分化：在脑出血后7-14天进行移植，存活细胞数量最多，早于或晚于此段时间脑内存活细胞数量显著减少；但细胞移植的时间越晚，分化为神经元的比例越高，反之，分化为星形胶质细胞的比例越高。但就细胞绝对数量而言，7-14天进行移植，可获得最高数量的分化神经元及星形胶质细胞。在脑出血后7-14天经颈动脉神经干细胞移植能够显著促进脑出血后大鼠神经系统功能的恢复。