论文部分内容阅读
柑橘是我国南方第一大水果,近年来随着我国柑橘产业迅速发展,采后生产成为实现柑橘周年供应、保持果实品质的关键环节。果实外观品质及内在品质作为柑橘市场竞争力的核心要素,在贮运过程中受到多种环境因素的影响,前期研究表明采后失水是引起果实品质下降及采后衰老的关键非生物因素。果实失水不仅与贮运环境密切相关,而且受到果实内部水分转运及表皮蜡质等因素的影响。细胞水平的水分转运过程主要由水通道蛋白（Aquaporins,AQPs）调节,这类主要膜内在蛋白广泛存在于植物细胞膜及液泡膜等内膜系统,参与调控植物水分平衡和逆境响应。AQPs在采后贮藏过程中的差异表达暗示了这类蛋白影响柑橘果实贮藏性能,然而关于AQPs的具体作用机制尚不清楚。本研究以贮藏期纽荷尔脐橙果实为主要实验材料,结合多种实验手段对柑橘AQPs开展了研究,旨在系统解析AQPs在采后失水过程中的生物学功能及相关调控机制。主要研究结果如下:1.维持贮藏环境湿度及使用酸性溶液处理有利于延缓柑橘果实采后失水:贮藏环境中湿度条件直接影响柑橘采后失水速率,低湿度贮藏环境加速果实采后失水和质地下降,使果实TSS含量升高;高湿度贮藏环境能够有效延缓果实采后失水,维持果实品质。此外,不同酸碱性溶液处理影响柑橘贮藏品质,碱性溶液（pH=9）处理加速果实采后失水和质地下降,而酸性溶液（pH=6）处理能够有效延缓果实采后失水、维持果实品质。上述结果表明,在柑橘采后贮藏过程中,维持贮藏环境湿度、使用酸性溶液处理能够降低果实失水速率,提高贮藏性能。2.柑橘AQPs在采后贮藏过程中的表达模式具有时空和品种特异性:甜橙基因组中共检索到39个柑橘AQPs,主要细分为5类:质膜内在蛋白（Plasma membrane intrinsic proteins,PIPs,12个）,液泡膜内在蛋白（Tonoplast intrinsic proteins,TIPs,9个）,类NOD26膜内在蛋白（NOD26-like intrinsic proteins,NIPs,10个）,小碱性膜内在蛋白（Small basic intrinsic proteins,SIPs,4个）及未知功能膜内在蛋白（X-intrinsic proteins,XIPs,4个）。不同柑橘品种中AQPs的基因数量及蛋白序列较为保守,而表达模式在贮藏过程中呈现品种特异性:多数AQPs（PIPs和TIPs）在紧皮柑橘（纽荷尔脐橙和HB柚）及温州蜜柑果皮中下调表达,而在椪柑和Fairchild橘果皮中普遍上调表达。值得注意的是,纽荷尔脐橙果皮中多数NIPs上调表达趋势在不受贮藏湿度条件的影响,PIPs和TIPs的下调表达趋势也是如此。此外,不同AQPs的表达模式在纽荷尔脐橙果皮和果肉中明显不同:果皮中多数AQPs在贮藏初期显著下调,而在果肉中AQPs在贮藏后期显著下调表达。上述结果表明,采后贮藏过程中,AQPs在紧皮柑橘果皮中的表达模式具有时间特异性,在果皮和果肉之间具有组织特异性,在紧皮柑橘和宽皮柑橘之间具有品种特异性。3.CsPIPs下调表达有利于延缓柑橘果实采后失水,并且受到CsMYB96调控:CsPIP1;1和CsPIP2;4是柑橘果皮中显著高表达的两个CsPIPs基因,在采后贮藏过程在下调表达。CsPIP1;1和CsPIP2;4是细胞质膜定位蛋白,在爪蟾卵母细胞中表达时具有水分转运活性,并且CsPIP2;4水分转运活性远高于CsPIP1;1;此外,瞬时超表达CsPIP2;4显著增加了金柑果实的失水速率。值得注意的是,CsMYB96能够特异性结合CsPIPs启动子序列抑制基因表达,同时通过结合蜡质相关基因（CERs和KCSs）的启动子序列激活基因表达。上述结果表明,在采后贮藏过程中,CsPIPs下调表达对于延缓果实失水具有重要作用;CsMYB96通过协同调控AQPs和蜡质合成相关基因参与调节柑橘采后失水。4.CsNIP5;1通过影响PIPs的膜定位和转录水平参与调控柑橘水分平衡,并且受到Cs WRKY4/28调控:CsNIP5;1在爪蟾卵母细胞中定位于细胞膜,并且具有水分转运活性。值得注意的是,CsNIP5;1在植物细胞中定位于内质网和圆环状结构,并且通过与PIPs相互作用使PIPs在质膜定位的蛋白量减少,进而导致细胞水分渗透系数降低。此外,超表达CsNIP5;1导致柑橘愈伤组织中多个AQPs显著下调表达,促进了多种渗透调节物（可溶性糖和脯氨酸等）的积累,显著增强了柑橘对失水的抵抗能力。转录因子Cs WRKY4和Cs WRKY28共同参与调控CsNIP5;1表达:Cs WRKY28在贮藏初期抑制CsNIP5;1表达,而Cs WRKY4在贮藏后期激活CsNIP5;1表达。上述结果表明,CsNIP5;1不仅影响PIPs的膜定位,而且通过间接作用抑制了PIPs的转录表达;贮藏期间,CsNIP5;1受到多个WRKYs转录因子的综合调控。以上研究结果为深入了解柑橘采后失水进程和调控机制提供了新见解,为后续使用基因工程等手段维持柑橘贮藏品质和遗传育种改良提供了理论依据。