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背景：伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma, BL)是一种高度侵袭性的B淋巴细胞肿瘤,其发病机制尚不清楚。研究发现,在BL细胞中存在细胞周期蛋白、凋亡蛋白、癌基因表达及细胞信号传导通路等方面的异常,而确切的发病机制还有待进一步研究。RON (Recepteur d’ Origine Nantais)属于原癌基因MET的家族,该家族是受体型酪氨酸激酶大家族中一组具有独特生物学功能的原癌基因。RON在生物种属的进化中不仅隶属于保守蛋白的范畴,同时亦在哺乳动物细胞的恶性转化和肿瘤形成中发挥重要的作用。RON主要表达在人体的各种上皮细胞,如肠,肺,乳腺上皮细胞,其配体是人巨嗜细胞刺激蛋白(MSP)。RON除在大肠癌、乳腺癌和细支气管肺泡癌中异常表达外,在淋巴瘤中也呈高度的异型性表达。RON可以调节细胞的迁移,侵袭和增殖,在侵袭性表型和促进肿瘤恶性转化中发挥重要作用。ZT/F2(2F2)是来源于鼠的IG2a单抗,特异性地识别RON β链的11号外显子,针对RON胞外段抗原决定簇。在BL中,RON是否存在异常表达以及其分子机制均未见报道。以及RON的单克隆抗体ZT/F2(2F2)2,在BL中能否抑制RON介导的信号传导以及致瘤效应?对于上述问题的研究,目前是不清楚的。鉴于此,我们从三个方面对原癌基因RON在伯基特淋巴瘤中的致瘤作用及其潜在的药靶效应进行了研究。第一部分RoN在淋巴瘤中的表达研究目的：研究RON在不同血液淋巴系统肿瘤组织及淋巴细胞系统细胞株中的表达情况。方法：通过免疫组织化学染色法检测浆细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤和T细胞淋巴瘤等患者以及正常和炎性淋巴组织的高密度组织芯片上RON蛋白的表达,计算RON阳性组织比例及RON蛋白表达阳性标记强度特征。蛋白免疫印迹法检测正常组织、炎性组织、弥漫大B细胞淋巴瘤组织、T细胞淋巴瘤组织、伯基特淋巴瘤组织、霍奇金淋巴瘤组织、慢性淋巴细胞白血病组织、骨髓瘤组织,以及用蛋白免疫印迹法检测淋系细胞株,包括阴性对照细胞株(3T3细胞株)、阳性对照细胞株(转染RON基因的3T3细胞株)、霍奇金淋巴瘤细胞株(L428细胞)、T细胞淋巴瘤细胞株(Jurkat细胞)、T细胞淋巴瘤细胞株(Molt-4细胞)、伯基特淋巴瘤细胞株(Raji细胞)、弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株(Pfeffier细胞和Farage细胞)、多发性骨髓瘤细胞株(RPMI8226细胞)中RON的表达情况。并且用原位杂交的方法检测EBER在伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的表达情况。结果：(1)RON在霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤组织中表达阳性率较高(p<0.05),在其他淋巴瘤组织以及正常淋巴组织中表达较低或者不表达。进一步对RON蛋白表达阳性的组织芯片进行阳性标记强度特征分析,发现霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤组织芯片中RON蛋白过度表达率均在30%以上(p<O.05)。(2)在霍奇金淋巴瘤细胞株(L428细胞)和伯基特淋巴瘤细胞株(Raji细胞)中RON表达水平较高(p<0.05),其它细胞株中弱表达或不表达。(3)霍奇金淋巴瘤中EB病毒的阳性率比伯基特淋巴瘤高(p<0.05),但是EB病毒阳性同时伴随RON阳性的比例,伯基特淋巴瘤较高(p<0.05)。结论：(1)RON基因在淋巴瘤中表达呈异质性,其中伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤中高表达；(2)RON基因在Raji细胞(伯基特淋巴瘤细胞株)和L428细胞(霍奇金淋巴瘤细胞株)中高表达,与组织中检测结果一致；而其它淋系的细胞株不表达或者弱表达。(3)伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤中EB病毒感染和RON基因阳性有一定的相关性。第二部分MSP影响Raji细胞生物学行为及ZT/F2(2F2)单抗的抑制效应目的：研究RON的特异性配体一MSP激活RON后,对表达RON的Raji细胞恶性生物学行为的影响,以及RON单克隆抗体ZT/F2(2F2)抗体对Raji细胞增殖抑制,诱导凋亡的机制。方法：采用MTT比色法研究MSP (2.0nM)刺激和ZT/F2(2F2)(2.0nM抗体处理24和72小时,对表达RON的Raji细胞和不表达RON的Jurkat细胞增殖的作用；通过观察集落计数,研究MSP刺激和ZT/F2(2F2)抗体处理对Raji细胞和Jurkat细胞集落形成的作用；通过Annexin V/PI双染法流式细胞仪检测MSP刺激和ZT/F2(2F2)抗体处理对Raji细胞凋亡的影响,并用Western Blotting检测凋亡相关蛋白的改变；用流式细胞术检测MSP刺激和ZT/F2(2F2)抗体处理引起的Raji细胞周期变化,并用Western Blotting检测G1期周期蛋白的改变。结果：(1)处理72小时,MSP单独刺激和MSP联合无关抗体处理的RON表达的Raji细胞增殖明显增加,而ZT/F2(2F2)抗体单独或者MSP和ZT/F2(2F2)联合处理72小时后,对Raji细胞增殖显著抑制(p<0.05)。MSP刺激24小时和72小时,对不表达RON的Jurkat细胞,未见明显增殖现象(p>0.05)。(2)MSP处理72小时,能够明显刺激RON表达的Raji细胞集落形成增多p<0.05),而ZT7F2(2F2)抗体单独或者MSP和ZT/F2(2F2)联合处理72小时,能够抑制Raji细胞的集落形成(p<0.05)。不表达RON的Jurkat细胞,MSP刺激24或者72小时,对克隆形成无明显影响(p>0.05),ZT/F2(2F2)也无抑制集落形成的效应(p>0.05)。(3)检测Raji细胞凋亡发现,ZT/F2(2F2)抗体处理组和MSP+ZT/F2(2F2)抗体处理组作用72小时,早期凋亡比例比空白对照组升高(p<0.05),ZT/F2(2F2)抗体处理组和MSP+ZT/F2(2F2)抗体处理组凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9和PARP表达水平增高,抗凋亡基因MCL-1和凋亡抑制蛋白XIAP表达水平下降。(4)检测细胞周期显示,ZT/F2(2F2)抗体处理组和MSP+ZT/F2(2F2)抗体处理组处理72小时,亚二倍体凋亡细胞百分数比空白对照组比较升高(p<0.05),和凋亡检测结果相对应；ZT/F2(2F2)抗体单独或者联合处理组的G1期比例增高(p<0.05),显示阻滞在G1期。ZT/F2(2F2)抗体处理组和MSP+ZT/F2(2F2)抗体处理组G1期周期蛋白cyclinD1、CDK4和CDK6水平降低,而P27蛋白水平升高。结论：(1)MSP能刺激表达RON的Raji细胞株增殖以及集落形成增多,促进细胞的恶性生物学行为；RON的单克隆抗体ZT/F2(2F2)能抑制MSP刺激的Raji细胞株增殖和集落形成。而对没有RON表达的Jurkat细胞株,则无此效应。(2) ZT/F2(2F2)抗体能调节凋亡相关蛋白的表达,诱导Raji细胞凋亡。(3)ZT/F2(2F2)通过改变G1期相关周期蛋白而实现G1期阻滞,从而对Raji细胞株增殖有抑制作用。第三部分MSP激活RON相关通路信号蛋白以及ZT/F2(2F2)单抗的拮抗作用目的：研究MSP激活RON磷酸化,并导致下游相关信号途径的癌性信息分子的磷酸化,单克隆抗体ZT/F2(2F2)体外、体内抑制RON下游信号途径的癌性信息分子的磷酸化的效应和机制,探讨RON在伯基特淋巴瘤中的药靶效应。方法：用Western Blotting检测MSP (2.0nM)刺激Raji细胞0,15分钟,30分钟60分钟’,120分钟’,引起RON的磷酸化和相关信号途径的癌性信息分子AKT、 ERK1/2和P38-MAPK以及NK-κB和β-catenin蛋白活化情况,并且以ZT/F2(2F2)(2.0nM)抗体处理60分钟,能够抑制MSP刺激的RON磷酸化和相关信号途径的癌性信息分子AKT、ERK1/2和P38-MAPK以及NK-κB的磷酸化水平和β-catenin蛋白的表达；用特异性信号通路阻断剂单独或者联合ZT/F2(2F2)抗体处理Raji细胞,观察信号通路活化情况的改变；通过Raji细胞荷瘤小鼠,观察ZT/F2(2F2)抗体对小鼠肿瘤生长的抑制,并通过免疫组化检测肿瘤组织TUNEL、RON、AKT和ERK1/2的表达。结果：(1)MSP能够激活Raji细胞RON的磷酸化,并引起PBK/Akt、p-38MAPK、 ERK1/2和NF-κB等信号途径的癌性信息分子的磷酸化和β-catenin表达增强,RON单抗ZT/F2(2F2)能抑制MSP刺激的RON蛋白的磷酸化,以及ERK1/2、AKT、P38和NF-kB等信号途径的癌性信息分子的磷酸化和β-catenin表达。(2)信号通路特异性抑制剂联合ZT/F2(2F2)抗体,均能增强对本信号途径的癌性信息分子磷酸化的抑制。AKT抑制剂或ERK1/2抑制剂联合ZT/F2(2F2)时,不仅能够抑制p-AKT或p-ERK1/2表达,对其他信号通路也有交互抑制作用。提示AKT和ERK1/2途径在ZT/F2(2F2)抑制RON介导的致瘤性信号通路中,起着关键的作用。(3) ZT/F2(2F2)抗体处理能显著抑制Raji细胞在小鼠体内的生长,包括肿瘤大小、重量、成瘤潜伏期等(p<0.05)。免疫组织化学染色显示,ZT/F2(2F2)能明显增加体内肿瘤细胞的凋亡(p<0.05),减少组织内肿瘤细胞表面RON受体的表达,并抑制肿瘤细胞AKT和ERK1/2的活性(p<0.05)。结论：(1)MSP刺激Raji细胞株RON磷酸化和相关信号途径的癌性信息分子激活,并能激活β-catenin; ZT/F2(2F2)单抗能抑制Raji细胞株RON磷酸化和相关信号途径的癌性信息分子的活化,并能抑制β-catenin表达。(2)AKT和ERK信号通路抑制剂联合ZT/F2(2F2),能交互抑制其他信号通路活化；提示AKT和ERK1/2途径在ZT/F2(2F2)抑制RON介导的信号通路中,可能起着关键作用。(3) ZT/F2(2F2)抗体处理能显著抑制Raji细胞在小鼠体内的生长,包括肿瘤大小、重量、成瘤潜伏期等。体内增强Raji细胞的凋亡,减少Raji细胞表面RON受体的表达,并抑制Raji细胞AKT和ERK1/2的活性。