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植物雄性不育在植物界广泛存在,利用雄性不育系生产杂交种子,可提高种子纯度,降低人工去雄成本。育种家通过各种遗传途径创造了大量雄性不育材料,但由于败育机理仍不十分清楚,限制了其应用。本研究利用iTRAQ技术构建雄性不育系K932S与恢复系K932R不同发育时期花药蛋白质表达谱,比较筛选差异表达蛋白(DEPs),通过生物信息学分析,Western blot和qRT-PCR等相关技术验证,明确与败育相关的DEPs和代谢途径,探讨其与K932S败育过程的关系,为后续研究应用提供依据。主要结果如下:1、iTRAQ鉴定结果,共鉴定到肽段32307个,蛋白质7440个。GO注释表明这些蛋白集中分布于细胞结构组分和细胞器,以结合活性和催化活性为主,主要参与氧化还原过程和代谢过程;COG功能主要包括翻译、核糖体结构组分和生物合成类和翻译后修饰、蛋白质转换和分子伴侣类;IPR注释主要有激酶结构域和RNA识别结构域;发现350条KEGG通路,主要包括碳代谢、核糖体、氨基酸、糖类和苯丙素生物合成等代谢通路。2、4个花药发育时期筛选出显著的DEPs共1648个,其中花粉母细胞、二分体、四分体和单核小孢子早期分别有370、591、526和858个,各时期特有的DEPs分别有210、288、163和530个,4个时期共有的DEPs 22个。二分体时期和单核小孢子早期DEPs数量较多,可能是败育的重要时期。DEPs的GO富集主要分布于细胞组分和细胞内组分,以催化活性和水解酶活性为主,参与代谢过程和有机物代谢过程;COG功能主要包括碳水化合物、脂类及氨基酸转移和代谢类;KEGG富集主要分布在核糖体、苯丙素生物合成、淀粉和蔗糖代谢、氨基酸代谢和脂肪酸代谢等通路上,这些代谢通路的DEPs可能与K932S败育过程相关。3、选取Histone H3、HSP17.7和Ubiquitin-like protein 5等3个DEPs,以β-actin为内参蛋白,Western blot验证结果与iTRAQ结果基本一致。选取长链脂肪酸代谢途径上的6个相关基因进行qRT-PCR表达分析,结果与对应蛋白质表达量趋势基本一致。K932S与K932R相比,花药中长链脂肪酸合成和延长相关基因从二分体时期到单核小孢子早期下调表达,分解相关基因在单核小孢子早期上调表达,可能导致长链脂肪酸含量不足,影响花药角质层和小孢子发育。4、通过气相色谱-质谱测定发现,K932S花药中软脂酸、硬脂酸、花生酸等5种游离长链脂肪酸含量在4个花药发育时期均低于K932R,其中二分体时期显著降低,四分体和单核小孢子早期部分游离长链脂肪酸显著降低。进一步证实了脂肪酸代谢异常与K932S败育密切相关。5、综上所述,推测K932S从二分体时期到单核小孢子早期,细胞凋亡通路和脂肪酸代谢相关蛋白差异表达,分别引起绒毡层PCD推迟和角质层退化,导致花药干瘪退化;脂肪酸、氨基酸和糖代谢相关蛋白差异表达,使小孢子发育所需物质和能量不足,小孢子个体小且畸形,自溶解体消失。花药退化和小孢子消失导致K932S无花粉型败育。