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目的:早产儿脑白质损伤(WMI)是早产儿脑损伤最常见的表现形式,严重者可发生脑室周围白质软化(PVL)。目前认为,WMI是导致早产儿远期不良神经预后的主要因素,其神经系统后遗症呈现多样性,涉及到肢体运动障碍、认知行为功能障碍、智力障碍及视觉、听觉障碍等。传统观点认为WMI病理改变主要涉及早期的少突胶质细胞损伤及后续的髓鞘化障碍。然而单纯的髓鞘化障碍无法充分解释WMI早产儿神经系统后遗症的多样性,突触损伤可能与后遗症多样性相关。研究者在尸检中发现,某些WMI患儿脑组织中存在神经元损伤,提示可能存在突触损伤,以丘脑区域最为明显。但目前该方面的研究不多,基于此病理改变的WMI治疗探索更加少见。早产儿WMI临床表现不典型,诊断滞后,且确诊后缺乏安全有效的治疗措施,一直是困扰新生儿医师的难点。多中心的临床随机对照研究发现,早产儿生后早期应用咖啡因防治呼吸暂停,可以有效降低支气管肺发育不良(BPD)发生率,改善神经系统远期预后。然而咖啡因改善早产儿神经预后是否通过改善早产儿WMI实现,目前尚不清楚。咖啡因是一种非特异性的腺苷受体阻断剂,能够有效的阻断腺苷受体的功能,尤其是A1及A2A受体,进一步影响呼吸中枢功能,改变呼吸节律,从而治疗早产儿呼吸暂停。但咖啡因改善早产儿神经预后的具体机制目前尚不明确。因此,本研究利用缺血缺氧诱导的新生大鼠脑白质损伤模型,研究缺血缺氧新生大鼠发生髓鞘化障碍的同时是否发生突触损伤,验证咖啡因是否对新生大鼠脑白质损伤具有神经保护作用,是否能改善髓鞘化障碍及突触损伤,并筛选咖啡因最佳用药剂量,探究咖啡因通过影响少突胶质细胞组蛋白乙酰化水平及BDNF/p-TrkB表达改善新生大鼠脑白质损伤的机制。研究方法:1.选取3日龄Sprague Dawley(SD)大鼠随机分为对照组和缺血缺氧(HI)组(每组均为82只)。缺血缺氧组于3日龄行右颈总动脉结扎后低氧暴露(8%氧气2.5h)制备脑白质损伤模型。分别于模型制备后3天,7天,14天,21天采集标本。采用HE染色观察脑组织病理改变;采用Western blotting检测突触前蛋白synaptophysin、突触后蛋白PSD-95、髓鞘蛋白MBP的表达;采用免疫荧光检测synaptophysin及MBP表达;采用免疫组化检测PSD-95表达;采用免疫荧光对少突胶质细胞总标志物Olig2染色,检测细胞数目;采用透射电镜检测突触数目及超微结构改变;采用水迷宫实验检测缺血缺氧新生大鼠的学习认知行为变化。2.选取2日龄大鼠80只随机分为5组(每组均为16只):对照组、缺血缺氧(HI)组、HI+咖啡因(10mg/kg)组、HI+咖啡因(20mg/kg)组、HI+咖啡因(50mg/kg)组。咖啡因于大鼠2日龄至6日龄连续腹腔内注射,共5天(每天一次),缺血缺氧处理依旧在3日龄进行。记录各组大鼠体重及脑重改变;采用Western blotting检测缺血缺氧后14天各组MBP表达,筛选最佳咖啡因剂量,以此剂量进行后续实验。3.选取2日龄大鼠54只随机分为3组(每组均为18只):对照组、HI组、HI+咖啡因(最佳剂量)组。咖啡因给药时间及方式同前,缺血缺氧处理依旧在3日龄进行。采用Western blotting检测各组缺血缺氧后14天synaptophysin及PSD-95表达,采用免疫荧光检测各组synaptophysin表达,采用透射电镜检测各组突触数目及超微结构改变;采用水迷宫实验检测各组大鼠的学习认知行为;水迷宫实验结束后大鼠进行MBP免疫组化检测和透射电镜髓鞘超微结构检测。4.选取2日龄大鼠64只随机分为4组(每组均为16只):对照组、HI组、HI+咖啡因组、HI+咖啡因+ANA-12组(TrkB抑制剂)。咖啡因给药时间及方式同前,缺血缺氧处理依旧在3日龄进行,ANA-12用药时间与咖啡因一致(2日龄至6日龄,腹腔内注射,每日一次,0.5mg/kg)。缺血缺氧后7天,乙酰化组蛋白AH3与Olig2免疫荧光双染检测蛋白表达,对BDNF、p-TrkB以及原始少突胶质细胞标志物PDGFR-α免疫荧光染色检测蛋白表达;缺血缺氧后14天,对成熟少突胶质细胞标志物PLP及MBP免疫荧光染色检测蛋白表达。结果:1.(1)缺血缺氧后大鼠少突胶质细胞减少,MBP表达下降:免疫荧光显示,缺血缺氧后7天,与对照组相比,HI组大鼠结扎侧胼胝体(CC)区少突胶质细胞数目减少(P<0.001),缺血缺氧后14天,髓鞘化的神经纤维长度缩短、密度下降。Western blotting显示,缺血缺氧后14天,HI组大鼠结扎侧CC区MBP表达低于对照组(P<0.01);(2)缺血缺氧后大鼠丘脑区突触超微结构及突触前后蛋白表达改变:透射电镜显示,缺血缺氧后14天,与对照组相比,HI组大鼠结扎侧丘脑区突触数目减少(P<0.01),突触AZ长度及PSD厚度均下降(P均<0.05)。Western blotting显示,HI组大鼠结扎侧丘脑区突触前蛋白synaptophysin在缺血缺氧后7天(P<0.05)、14天(P<0.01)均低于对照组,而突触后蛋白PSD-95在缺血缺氧后14天(P<0.01)、21天(P<0.05)低于对照组;(3)缺血缺氧后大鼠的学习认知能力下降:水迷宫测试显示,与对照组相比,HI组大鼠在定位航行测试中逃避潜伏期延长(P均<0.05),在空间探索测试中,HI组大鼠穿越平台次数显著减少(P<0.01),目标象限运动时间缩短(P<0.05)。2.(1)不同剂量咖啡因干预后大鼠的体重、脑重改变:缺血缺氧后14天,与对照组相比,HI+咖啡因(50mg/kg)组大鼠出现体重及脑重下降(P均<0.05),而HI+咖啡因(20mg/kg)组体重及脑重均与对照组无差异;(2)不同剂量咖啡因干预后大鼠MBP表达改变:Western blotting显示,缺血缺氧后14天,HI+咖啡因(20mg/kg)组大鼠结扎侧CC区MBP表达高于HI组(P<0.05),而HI+咖啡因(50mg/kg)组及HI+咖啡因(10mg/kg)组MBP表达与HI组无统计学差异。结果表明,咖啡因干预剂量20mg/kg对缺血缺氧新生大鼠MBP下降改善效果最佳,选此剂量进行后续实验。3.(1)咖啡因改善缺血缺氧大鼠的学习认知能力:水迷宫测试显示,与HI组相比,HI+咖啡因组大鼠在定位航行测试中逃避潜伏期缩短(P均<0.05),在空间探索测试中,HI+咖啡因组大鼠穿越平台次数增加(P<0.05),目标象限运动时间延长(P<0.05);(2)咖啡因对缺血缺氧大鼠MBP表达以及髓鞘超微结构的影响:MBP免疫组化显示缺血缺氧后30天,与HI组相比,HI+咖啡因组大鼠结扎侧CC区向皮层投射的髓鞘化神经纤维长度延长、密度增加;透射电镜显示,与HI组相比,HI+咖啡因组大鼠髓鞘结构更加规则,髓鞘化轴突数目增多;(3)咖啡因对缺血缺氧大鼠突触超微结构及突触前后蛋白表达的影响:透射电镜显示,与HI组相比,HI+咖啡因组大鼠结扎侧丘脑区突触数目增加(P<0.05),但突触AZ长度及PSD厚度与HI组无显著差异;Western blotting显示,缺血缺氧后14天,HI组结扎侧丘脑区synaptophysin(P<0.01)及PSD-95(P<0.05)表达均低于对照组,而HI+咖啡因组synaptophysin及PSD-95的表达与HI组无显著差异。4.(1)咖啡因增加缺血缺氧新生大鼠乙酰化组蛋白AH3及下游BDNF/p-TrkB表达:免疫荧光定量分析显示,与对照组相比,缺血缺氧后7天,HI组大鼠结扎侧CC区少突胶质细胞AH3表达下降(P<0.01),其下游的BDNF及p-TrkB表达减少(P均<0.01),与HI组相比,HI+咖啡因组大鼠少突胶质细胞AH3表达增加(P<0.05),其下游BDNF(P<0.01)及p-TrkB(P<0.001)表达水平也升高;(2)咖啡因促进缺血缺氧新生大鼠少突胶质细胞分化:免疫荧光定量分析显示,与对照组相比,HI组大鼠结扎侧CC区成熟少突胶质细胞标记物PLP(P<0.01)及MBP(P<0.001)表达下降,而原始少突胶质细胞标记物PDGFR-α表达无显著改变;与HI组相比,HI+咖啡因组PDGFR-α(P<0.01)、PLP(P<0.05)表达均增多,MBP表达升高(P<0.01);(3)TrkB抑制剂ANA-12减弱咖啡因促进缺血缺氧新生大鼠少突胶质细胞分化的效用:免疫荧光定量分析显示,与HI+咖啡因组相比,HI+咖啡因+ANA-12组p-TrkB表达下降(P<0.01),PDGFR-α、PLP及MBP表达均减少(P均<0.05)。结论:1.缺血缺氧诱导的新生大鼠WMI不仅局限于脑室旁白质髓鞘化障碍,同时伴随丘脑区突触超微结构异常,为早产儿WMI提供了更加全面的病理诠释。2.咖啡因通过改善脑室旁白质髓鞘化障碍对缺血缺氧新生大鼠WMI发挥神经保护作用,提高其认知及学习能力,但对异常的突触超微结构无显著改善,为早产儿WMI的临床治疗提供了新的方向。3.咖啡因能够提高缺血缺氧新生大鼠少突胶质细胞中乙酰化组蛋白AH3水平,上调BDNF及p-TrkB表达,促进少突胶质细胞分化,最终改善髓鞘化障碍,可能是咖啡因对缺血缺氧诱导的新生大鼠WMI发挥神经保护作用的机制。