中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又称河蟹,属甲壳纲,十足目,方蟹科,绒螯蟹属,目前已经成为我国重要养殖的经济蟹类。脂类在鱼类、虾蟹类等水产动物的生长、生理活动中发挥十分重要的作用,而肝胰腺是中华绒螯蟹脂类代谢中心,脂类含量对其结构、功能和生化组成具有重要影响。脂肪酸结合蛋白FABP的种类和分布与其结合的脂肪酸、组织的脂肪酸需求及其参与的功能有着密切关系。研究表明甲壳动物FABP的种类分化较少但参与多种生理过程,而目前对其配基及亲和力及功能的研究甚少。本研究在已有的研究结果基础上,采用RT-PCR技术从中华绒螯蟹肝胰腺组织中克隆了FABP3、FABP9和FABP10基因,通过分子生物学手段构建原核表达载体,经过表达和纯化获得Es-FABP3、9和10三种可溶性目的蛋白并以此蛋白作为材料,利用稳态荧光光谱对中华绒螯蟹FABP与脂肪酸等疏水配基的亲和力进行分析,并在离体条件下通过荧光定量PCR研究单一脂肪酸对Es-FABP3、9和10的调控作用。通过以上研究阐明中华绒螯蟹FABP与脂肪酸的亲和力,脂肪酸代谢相关基因FABP3、FABP9和FABP10在不同脂肪酸调控下的相互作用关系,同时为甲壳动物FABP分化与功能研究的深入提供基础资料。主要研究结果和结论具体如下:1、FABP3、FABP9、FABP10原核表达及蛋白纯化通过NCBI Gen Bank数据库查询3中脂肪酸结合蛋白核苷酸序列,根据FABP3、FABP9和FABP10的核苷酸序列设计扩增引物,在上下游分别插入酶切位点Bam HI和Nde I。从中华绒螯蟹肝胰腺组织中提取总RNA,通过RT-PCR技术得到cDNA,以此为模板进行TA克隆得到带有酶切位点的FABP3、FABP9和FABP10基因,将扩增产物回收并纯化,电泳分析其条带约为400bp,与预期结果相符。将获得的目的基因与pMD-19T载体连接,PCR鉴定并测序,将测序正确的质粒酶切后回收目的片段。将目的基因正向插入pET-15b中,构建原核表达载体pET-15b-FABP3、pET-15b-FABP9和pET-15b-FABP10,将这三种质粒转化入宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导成功表达了目的蛋白,经过SDS-PAGE电泳显示,蛋白质分子质量均在15KD左右,与预期结果相符。利用融合蛋白中带有的His标签,经过镍离子柱亲和层析纯化表达的FABP3、FABP9和FABP10,以此为材料进行后续实验。2、FABP3、FABP9、FABP10与不同脂肪酸亲和力分析获得中华绒螯蟹脂肪酸结合蛋白FABP3、FABP9和FABP10重组可溶性蛋白后,采用稳态荧光技术研究不同脂肪酸与中华绒螯蟹FABP3、FABP9和FABP10的结合特性。利用ANS作为荧光标记,通过稳态荧光发射光谱研究脂肪酸与三种FABP的结合,通过解离常数的计算最终计算得到FABP3、FABP9和FABP10与不同脂肪酸亲和力大小。结果显示FABP3与长链脂肪酸有较高亲和力,FABP9与不同脂肪酸的亲和力大小随着碳链的延长,亲和力逐渐变小,FABP10则与短链脂肪酸有较高的亲和力。因此我们推测FABP3、FABP9和FABP10与不同脂肪酸亲和力不同与FABP的功能以及内腔结构的不同相关。3、不同脂肪酸作用肝胰腺其FABP3、FABP9和FABP10表达变化本论文采用离体培养技术,旨在研究不同脂肪酸水平对中华绒螯蟹肝胰腺中脂肪酸结合蛋白FABP3,FABP9和FABP10表达量的影响。取中华绒螯蟹肝胰腺组织进行体外培养,在液体培养基中分别加入50μm/L,100μm/L和250μm/L三种浓度的棕榈酸(PA),油酸(OA),亚油酸(LA),花生四烯酸(ARA),DHA和EPA六种脂肪酸。分别在离体培养24小时后,运用Real-Time PCR技术,研究组织内FABP3、FABP9和FABP10在不同种脂肪酸作用下的表达变化。结果表明,在培养基中加入50μm/L,100μm/L,250μm/L DHA、EPA和亚油酸,体外培养24h后,都促进了FABP9基因的表达。其中DHA组在100μm/L时FABP9基因的表达量最高;而FABP3和FABP10的表达量在加入三种浓度DHA条件并未受到显著影响。亚油酸组则在250μm/L时FABP9的表达量最高;而FABP3和FABP10基因表达量在加入三种浓度DHA条件并未受到显著影响。在培养基中添加三种浓度的花生四烯酸,油酸和棕榈酸体外培养24 h后,FABP3、FABP9和FABP10的表达量都没有显著性差异。FABP3、FABP9和FABP10的表达水平对脂肪酸的种类和浓度反应不同,可能与实验动物所处的生理时期及对脂肪酸的需求有关。