第一部分胃癌组织及血清VEGF-C表达与胃癌的相关性背景胃癌(Gastric cancer,GC)是一种常见的消化道恶性肿瘤。病死率在所有恶性肿瘤中居第4位。近年来,随着人们生活方式的和饮食习惯的改变,胃癌在我国的发病率迅速升高,并且患者具有年轻化的趋势。因此,胃癌的防治仍是当下重要的公共卫生问题。胃癌是来源于腺体上皮的恶性肿瘤,即胃腺癌,占所有胃癌类型的95%以上。其主要转移方式为淋巴系统转移。有研究表明:与淋巴结转移阴性的早期胃癌相比,伴有周围淋巴结转移的早期胃癌5年生存率明显下降,二者具有显著统计学差异。目前认为,多种因素和复杂的步骤参与了胃癌的发生和发展。其中,新生的淋巴管和血管发挥重要作用。肿瘤的生长依赖于血液供应,营养物质通过血管参与了胃癌的生长、渗透和远处血行转移。淋巴转移是胃癌更常见的转移方式。淋巴管散在地分布在肿瘤组织内,其边缘区域密度较高,是肿瘤细胞发生淋巴结转移的解剖学基础。新生的淋巴管结构不完整,缺乏基底膜及平滑基层,肿瘤细胞易进入淋巴管,产生淋巴转移。因此,有效抑制淋巴管的新生可能是防止胃癌早期淋巴结转移、改善预后的关键因素。血管及淋巴管的新生与血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)家族高度相关。当胃癌发生时,VEGF的表达升高,直接参与了血管新生。而在胃癌组织中,VEGF-C的表达与淋巴管密度及周围淋巴结转移间的关系尚不完全明确。除外肿瘤组织,血液循环中也有少量VEGF-C的存在,其浓度大致反应了肿瘤的生长及淋巴结转移的情况,血液中大部分VEGF-C是由肿瘤细胞产生并释放入血液。在胃癌患者中,血液中VEGF-C浓度的改变与胃癌的关联性尚不明确。目的本部分研究将通过检测胃癌患者肿瘤组织中VEGF-C的表达情况,探究其与胃癌临床病理学方面的关系;并通过检测胃癌患者血清中VEGF-C的水平,比较胃癌手术前后血清VEGF-C浓度的改变,探究其浓度与临床各项指标的相关性,以期对临床胃癌患者指导术前分期提供参考依据。方法收集144例胃癌患者、46例胃溃疡患者(对照组)及120例健康人群清晨空腹外周血(胃癌和胃溃疡患者在术前一天抽取),提取收集上层血清,放置于-80℃冻存留待检测。手术中收取胃癌患者和胃溃疡患者的胃组织标本,保存于-80℃冰箱及RNAlater液中,分别用于蛋白质水平和mRNA水平的检测。结果1.胃组织中VEGF-C的mRNA表达水平在对照组、淋巴结转移阴性的胃癌组织及淋巴结转移阳性的胃癌组织中,三者VEGF-C的mRNA表达水平依次升高。无论是否伴有淋巴结转移,VEGF-C的mRNA表达水平在胃癌组均显著高于对照组(P<0.05)。其中,相比于淋巴结转移阴性的胃癌组织,VEGF-C的mRNA水平在淋巴结转移阳性的胃癌组织中升高更加显著(P<0.05)。2.胃组织中VEGF-C的蛋白质表达水平对照组标本中VEGF-C的蛋白质相对表达水平最低,在淋巴结转移阴性的胃癌组织和淋巴结转移阳性的胃癌组织中,其蛋白质相对表达水平依次升高,与对照组相比均有显著统计学差异(P<0.05)。其中,淋巴结转移阳性胃癌组织中的VEGF-C蛋白质表达水平显著高于淋巴结转移阴性的胃癌组织(P<0.05)。该部分蛋白质表达的结果与mRNA的结果具有高度一致性。3.胃癌淋巴管密度(LVD)与临床病理学特征的相关性我们进一步对胃癌组织中淋巴管密度和胃癌患者的临床病理学特征进行了相关性分析。TNM分期在Ⅰ、Ⅱ期的患者,其淋巴管的密度显著低于Ⅲ、Ⅳ期的患者(5.02±2.71vs.13.55±3.11,P<0.05);合并周围淋巴结转移的患者,其淋巴管密度显著高于周围淋巴结阴性的患者(13.21±3.05vs.5.17±2.96,P<0.05);对于肿瘤的分化等级,在中高分化和低分化患者中,淋巴管密度未见显著差别(6.22±3.13 vs.7.84±3.18,P>0.05)。该结果说明胃癌组织局部淋巴管密度可能与周围淋巴结转移呈正相关。4.胃癌微血管密度(MVD)与临床病理学特征的相关性与淋巴管密度和胃癌相关性分析类似,我们使用同样的方法统计了微血管密度和胃癌患者临床病理学特征的相关性,结果发现:TNM分期在Ⅰ、Ⅱ期的患者,其微血管密度显著低于Ⅲ、Ⅳ期的患者(5.27±2.65 vs.12.41±1.98,P<0.05);合并周围淋巴结转移的患者,其微血管密度显著高于周围淋巴结阴性的患者(12.42±4.76vs.7.62±3.12,P<0.05);对于肿瘤的分化等级,在中高分化和低分化患者中,微血管密度未见显著差别(6.59± 1.98 vs.6.92±2.56,P>0.05)。该结果与淋巴管密度的结果具有一致性。5.VEGF-C与胃癌临床特征的相关性无论是VEGF-C的mRNA还是蛋白表达水平,均与病人的性别、年龄和组织学分化程度无关(P>0.05),而与患者的TNM分期及淋巴结转移相关(P<0.05)。本部分结果显示,在VEGF-CmRNA及蛋白质表达水平较高的患者,其组织学分化水平更差,周围淋巴结转移的可能性更高。6.VEGF-C与微血管密度及淋巴管密度的相关性我们进一步分析了 VEGF-C在mRNA和蛋白质两个水平表达量与胃癌组织微血管密度及淋巴管密度的相关性。结果显示在胃癌组织中微血管密度及淋巴管密度与VEGF-C的mRNA及蛋白质表达水平均具有正相关性(P<0.05)。7.健康人群、胃溃疡对照组和胃癌患者术前组血清VEGF-C水平比较为了进一步明确VEGF-C与胃癌临床病理学的关系,我们针对血清中的VEGF-C进行了分析。结果发现在健康人群、胃溃疡患者及胃癌患者术前血清中VEGF-C 浓度分别为(116.80±26.92)pg/ml、(130.64±20.16)pg/ml 和(389.68±160.70)pg/ml。与健康人群和胃溃疡患者相比,胃癌患者血清中VEGF-C浓度明显增高(P<0.05),具有显著统计学差异;而健康人群和胃溃疡患者间相比无显著统计学差异(P>0.05)。8.胃癌患者术前血清VEGF-C水平与胃癌临床特征间的关联(1)性别比较男性胃癌患者和女性胃癌患者的血清VEGF-C水平,二者分别为(382.61 ± 144.83)pg/ml 和(428.65± 158.36)pg/ml,统计分析发现两者无显著统计学差异(P>0.05)。(2)年龄以60岁为界,比较不同年龄段胃癌患者血清内VEGF-C水平的差异。结果发现:小于60岁胃癌患者血清VEGF-C的浓度为(390.63±152.17)pg/ml;大于等于60岁胃癌患者为(406.12±150.24)pg/ml,两者相比无显著统计学差异(P>0.05)。(3)TNM分期检测结果发现,随着TNM分期的进展,血清内VEGF-C水平显著升高,Ⅰ期、Ⅱ期患者与Ⅲ期、Ⅳ期患者血清VEGF-C浓度分别为(257.73±72.14)pg/ml和(532.42±121.86)pg/ml,两者相比具有显著统计学差异(P<0.05)。(4)淋巴结转移有周围淋巴结转移者血清VEGF-C浓度为(513.86±182.06)pg/ml,显著高于无周围淋巴结转移者(360.14±136.56)pg/ml,具有显著统计学差异(P<0.05)。(5)分化等级结果显示:血清VEGF-C水平在中高分化胃癌组为(337.26±130.06)pg/ml,在低分化胃癌组为(429.68± 178.80)pg/ml,二者间具有显著统计学差异(P<0.05)。9.血清VEGF-C浓度在胃癌手术前后的变化在所有亚组中,胃癌术后患者血清中VEGF-C浓度均显著下降,与术前相比均有显著统计学差异(P<0.05)。该结果说明,胃癌患者术前血清中高浓度的VEGF-C可能主要来源于肿瘤组织。结论胃癌组织中VEGF-C的表达与淋巴结转移密切相关。VEGF-C可能通过肿瘤血管生成和淋巴管新生参与了胃癌的进展过程,抑制VEGF-C的活性或可减缓肿瘤的生长及转移,起到抗肿瘤的治疗效果。血清中VEGF-C的水平可以作为反映肿瘤进展和手术预后的有效指标,或可被用于术前评估胃癌患者病情及术后监测肿瘤复发,在指导优化临床治疗方案方面具有潜在利用价值。第二部分VEGF-C基因多态性与胃癌的相关性背景基因变异是导致肿瘤发生的因素之一。其中,单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism,SNP)是人类可遗传变异中最常见的一种,并且与某些类型肿瘤的发病风险有关。SNP指的是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP在人类基因组中广泛存在,并且在肿瘤研究领域有着广阔的应用前景。SNP根据其是否在蛋白编码区域分为编码区SNP和非编码区SNP,部分位于编码区的SNP可以引起编码蛋白中氨基酸的改变,从而起到致癌作用。在第一部分研究中我们发现,胃癌组织及血清中VEGF-C的浓度明显上升,并且与淋巴结转移、微血管密度(MVD)及淋巴管密度(LVD)相关。然而,VEGF-C表达上升的具体机制尚不明确,推测可能与VEGF-C的基因多态性有关。目前,超过60个SNP位点在VEGF-C基因中被发现,部分位点与疾病的发生相关。例如,VEGF-C多态性位点rs1485766 A/A型的人群患肝细胞肝癌的风险增高,说明该多态性位点可以在一定程度上预测肿瘤的发生。目前,尚没有VEGF-C基因单核苷酸多态性与胃癌相关性的报道。目的本部分研究以胃癌患者(病例组)及健康人群(对照组)为研究对象,通过对VEGF-C基因的编码区和非编码区进行测序,探索VEGF-C基因SNP与胃癌间的关联性。为胃癌病因学研究及临床指导提供理论依据。方法采集胃癌患者(病例组,144例)及健康人群(对照组,120例)外周血样本,提取外周血液DNA,设计VEGF-C基因引物,进行预实验验证后使用。对VEGF-C基因外显子区域和已知的3个内含子区域的SNP位点进行基因测序。将两组数据进行序列对比,使用SPSS16.0软件对比分析两组测序发现的SNP位点基因型和基因频率。结果通过对胃癌患者和健康人群VEGF-C基因测序,我们在外显子区域发现了 3个已知的SNP位点,分别为位于1号外显子的rs535702112,位于4号外显子的rs772765057和位于6号外显子的rs766890973,均属于同义单核苷酸碱基改变。3个位于内含子区域的SNP分别是rs1485766、rs11947611和rs7664413。病例组和对照组之间基因多态性的基因型和相关性见表1。我们分别分析了这6个SNP位点的基因型频率和等位基因频率,结果发现病例组与对照组相比均无显著统计学差异。rs535702112、rs772765057、rs766890973、rs1485766、rs11947611 和rs7664413位点在病例组和对照组等位基因频率最高的碱基对分别为:纯合子GG,纯合子GG,杂合子TC,纯合子AA,纯合子CC,纯合子CC。通过综合变量分析,相比于对照组,胃癌患者病例组中带有以上各个SNP位点并无明显意义。在本部分研究中,我们根据不同的临床指标将胃癌患者分为3个亚组,包括TNM临床分期、是否伴有淋巴结转移及分化程度,然后通过分别对比各个亚组与正常人群SNP等位基因的频率,研究VEGF-C基因多态性对胃癌病理学特征的影响。结果显示,对照组与病例组相比,多态性位点rs535702112,rs772765057,rs766890973,rs1485766,rs11947611,rs7664413 与胃癌临床病理改变并无相关性。结论VEGF-C基因的单核苷酸多态性位点与胃癌的易感性及临床病理学特征均无显著相关性。提示胃癌患者VEGF-C蛋白质及mRNA表达水平的升高与VEGF-C的单核苷酸多态性无关。