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研究背景脓毒症的免疫抑制阶段是机体在度过细胞因子风暴阶段后出现的对二次感染抵抗力降低,进而导致脓毒症患者死亡的主要原因,尚无有效治疗手段。先天免疫细胞对病原体刺激的反应性降低是免疫抑制的主要表现,其中以巨噬细胞脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）耐受状态最为典型。LPS耐受,是指长期暴露于LPS后形成的特殊细胞状态,该状态下巨噬细胞对LPS二次刺激的反应性降低,表现为促炎因子（TNF-α、IL-6）释放显著减少。自噬是真核生物高度保守的自我保护机制,与机体的免疫系统密切相关,对免疫细胞促炎因子释放及清除病原体功能具有重要的调控作用。钙离子信号作为自噬机制的重要调节因素,对自噬具有双向调控作用。因此,以钙离子信号为靶点,上调自噬水平,恢复LPS耐受巨噬细胞促炎因子释放和清除病原体能力,可能是治疗脓毒症免疫抑制的可行策略。本课题组前期研究发现,青蒿琥酯能逆转盲肠穿孔结扎（cecal ligation puncture,CLP）诱导的脓毒症小鼠免疫抑制状态,具体体现在静脉注射青蒿琥酯后,可显著增加血液、脾脏及肺脏中TNF-α、IL-6的水平,降低血液、脾脏及肺脏中的细菌数量,提高免疫抑制小鼠的生存率;其机制与青蒿琥酯通过胞核维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）介导的基因效应进而调控自噬密切相关。VDR以胞膜受体（membrane VDR,mVDR）和胞核受体（nuclear VDR,n VDR）两种形式存在于多种细胞中,分别介导维生素D的快速效应和基因效应,参与调节机体钙磷代谢、细胞凋亡、免疫应答及自噬等多种生理功能。已有研究表明,m VDR能介导维生素D的快速效应,调控钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）活化以及下游钙离子通道,进而影响细胞免疫调节相关的自噬信号通路。因此,本研究围绕m VDR的快速效应,以LPS耐受巨噬细胞作为脓毒症免疫抑制的细胞模型,深入探讨青蒿琥酯逆转脓毒症免疫抑制的分子机制。研究目的建立小鼠腹腔巨噬细胞LPS耐受模型,围绕m VDR的快速效应深入研究青蒿琥酯逆转LPS耐受的分子机制。研究方法1.LPS耐受模型的建立及其自噬相关特征研究取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞培养,贴壁后,用低剂量LPS（5 ng/m L）处理4 h诱导巨噬细胞耐受,再用高剂量LPS（100 ng/m L）刺激巨噬细胞4 h,ELISA检测上清中促炎因子TNF-α和IL-6水平以验证耐受模型是否建立成功;细胞细菌计数法检测LPS耐受巨噬细胞吞噬能力和清除细菌能力的改变;Western blotting和免疫荧光法检测LPS耐受巨噬细胞的自噬水平;应用钙离子探针Fluo-4 AM、无钙DMEM等检测LPS耐受巨噬细胞钙离子变化及来源。2.青蒿琥酯对LPS耐受巨噬细胞自噬调控作用的研究ELISA和细胞细菌计数法分别检测青蒿琥酯对LPS耐受巨噬细胞TNF-α、IL-6释放和清除细菌能力的影响以及自噬抑制剂3-MA对青蒿琥酯的干预作用;Western blotting和免疫荧光法检测青蒿琥酯对LPS耐受巨噬细胞自噬水平（利用溶酶体抑制剂Bafilomycin A1判断自噬流）、CaMKⅡ磷酸化的影响;应用钙离子探针Fluo-4 AM检测青蒿琥酯对LPS耐受巨噬细胞钙离子水平的影响;应用KN-93（CaMKⅡ抑制剂）、2-APB（内质网IP3通道阻断剂）和BAPTA（钙离子螯合剂）验证青蒿琥酯的作用与CaMKⅡ-IP3R-Ca2+通路间的关系;应用VDR抗体和激动剂1α,25（OH）2D3判断青蒿琥酯的作用与mVDR的关系。3.青蒿琥酯恢复LPS耐受巨噬细胞自噬功能的机制研究应用ULK1抑制剂ULK-101判断青蒿琥酯恢复LPS耐受细胞自噬功能与ULK1的关系;应用ULK1不同磷酸化位点（Ser317、Ser637、Ser757）的抗体明确青蒿琥酯恢复LPS耐受细胞自噬功能与ULK1不同位点磷酸化之间的关系;应用ULK1相关的钙离子通路抑制剂（m TOR抑制剂Rapamycin、AMPK抑制剂Compound C、CaMKKβ抑制剂STO-609）对相应激酶磷酸化的干预,进一步明确青蒿琥酯恢复LPS耐受细胞自噬功能的分子机制。研究结果1.LPS耐受模型的建立及其自噬相关特征研究结果小鼠腹腔巨噬细胞经LPS 5 ng/m L诱导4 h后,在LPS 100 ng/m L二次刺激下,与正常巨噬细胞经LPS 100 ng/m L单独刺激相比,TNF-α、IL-6释放显著降低,提示LPS耐受模型建立成功;LPS耐受巨噬细胞特征包括:清除细菌能力显著降低;自噬水平显著降低,且自噬功能无法被LPS二次诱导;钙离子水平显著升高,且钙离子主要来源于内质网IP3通道释放。2.青蒿琥酯对LPS耐受巨噬细胞自噬调控作用的研究结果青蒿琥酯增强了LPS耐受巨噬细胞在LPS二次刺激下的TNF-α、IL-6释放及细胞清除细菌的能力,但该作用被自噬抑制剂3-MA所拮抗;通过对自噬的研究,证实了青蒿琥酯增强LPS耐受巨噬细胞TNF-α、IL-6释放和清除细菌的能力与恢复自噬启动功能密切相关;深入研究发现,青蒿琥酯恢复LPS耐受巨噬细胞自噬启动与抑制过度磷酸化的CaMKⅡ,进而下调内质网IP3通道钙离子释放有关;VDR抗体或激动剂1α,25（OH）2D3均能拮抗青蒿琥酯抑制CaMKⅡ过度磷酸化进而下调IP3通道的Ca2+释放的作用,从而阻断青蒿琥酯对自噬的调控。3.青蒿琥酯恢复LPS耐受巨噬细胞自噬功能的分子机制研究结果ULK1抑制剂ULK-101能显著抑制青蒿琥酯恢复LPS耐受巨噬细胞自噬功能和TNF-α释放;通过对LPS耐受巨噬细胞ULK1不同磷酸化位点的研究,发现青蒿琥酯通过抑制ULK1-Ser637（自噬抑制性位点,由过度磷酸化的AMPK激活）磷酸化,进而恢复LPS诱导的ULK1-Ser317（自噬促进性位点,由正常磷酸化的AMPK激活）启动自噬功能;对ULK1上游调控分子AMPK和m TOR磷酸化水平的进一步研究证实,青蒿琥酯通过Ca2+-CaMKKβ-AMPK通路,部分抑制过度磷酸化的AMPK,进而导致AMPK调控的ULK1-Ser637去磷酸化,解除其自噬抑制作用。研究结论1.LPS 5 ng/m L处理小鼠腹腔巨噬细胞4 h,能诱导稳定的LPS耐受模型;该模型的特征除了促炎因子释放减少,还包括清除细菌能力减弱、自噬水平降低以及胞内来源于内质网IP3通道释放的钙离子水平升高。2.青蒿琥酯通过m VDR介导的快速效应抑制CaMKⅡ-IP3R-Ca2+通路,减少内质网IP3通道钙离子释放,减弱钙离子信号对自噬的抑制作用,恢复LPS耐受巨噬细胞自噬启动功能,进而增加促炎因子释放、增强清除细菌能力。3.青蒿琥酯通过Ca2+-CaMKKβ-AMPK通路,部分抑制过度磷酸化的AMPK,导致ULK1-Ser637（自噬抑制性位点,由过度磷酸化的AMPK激活）去磷酸化,进而恢复LPS诱导的ULK1-Ser317（自噬促进性位点,由正常磷酸化的AMPK激活）启动自噬功能。